一.培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過程：潛伏期→指數(shù)增生期→停滯期
1.1 潛伏期(latent phase)
   細(xì)胞接種后,先經(jīng)過一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮, 胞體呈圓球形.然后細(xì)胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束. 細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢,可達(dá)10-24 小時(shí)或更多, 而傳代細(xì)胞系貼壁速度快, 通常10-30 分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期.原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24-96 小時(shí)或更長(zhǎng), 連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅需6-24 小時(shí)。
1.2 指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)
   這是細(xì)胞增殖**旺盛的階段，分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI）表示，即細(xì)胞群中每1000 個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%，原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá)3％－5％。指數(shù)增生期的細(xì)胞活力**好時(shí)期，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)**佳時(shí)期，也是凍存細(xì)胞的**好時(shí)機(jī)。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3－5 天后，隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間減少，**后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。
1.3 停滯期(Stagnate phase)
   細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞就會(huì)停止增殖，進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)持平，故也稱平臺(tái)期（Plateau phase）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)。如不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會(huì)因培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會(huì)脫落，嚴(yán)重的會(huì)發(fā)生死亡。
為了維持細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，必須進(jìn)行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。
二.細(xì)胞傳代方法
  根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)，傳代方法有3種
2.1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代
多采用離心法傳代。1000轉(zhuǎn)/分,20-30秒后去上清。沉淀細(xì)胞加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。亦有直接傳代法，即懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí)，將上清培養(yǎng)液去除1/2-1/3，然后用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。本實(shí)驗(yàn)采用此法。
2.2半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代
此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁上脫落下來，進(jìn)行傳代。直接吹打?qū)Υ祟惣?xì)胞有損傷，亦可采用酶消化法傳代。
2.3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代
 必須采用酶消化法。常用的消化液有0.05%~0.25%的胰蛋白酶液，0.1%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA（1:2~1:4）的混合消化液，等等
三.培養(yǎng)細(xì)胞常規(guī)檢查
細(xì)胞接種或傳代后，要定時(shí)對(duì)細(xì)胞做常規(guī)檢查，如觀察培養(yǎng)液pH（顏色變化）、清亮度（是否污染）和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)等，隨時(shí)掌握細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)異常情況及時(shí)對(duì)癥處理。
1. 營(yíng)養(yǎng)液pH值：新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液呈橙紅色（pH7.2左右），適合多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)積累增多，營(yíng)養(yǎng)液酸化變黃，pH值下降；若培養(yǎng)瓶瓶塞刷洗不潔，殘留堿性物質(zhì)，致營(yíng)養(yǎng)液pH值升高，顏色變紫紅色。兩種變化均對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)不利。采用5%CO2與95%空氣混合氣體，37℃條件培養(yǎng)細(xì)胞，可使培養(yǎng)液pH值在一定時(shí)間內(nèi)保持在pH7.2左右。更換營(yíng)養(yǎng)液的時(shí)間可依靠營(yíng)養(yǎng)物消耗而定，一般情況下，每周換液兩次，每次換半量或1/3量。
2.微生物污染及排除
  污染包括微生物污染、細(xì)菌污染、霉菌污染、支原體污染、病毒污染（參閱有關(guān)參考書）
  其排除，良好的無菌操作技術(shù)是控制污染的基礎(chǔ)。污染時(shí)shou先找出污染原因。針對(duì)不同原因有相應(yīng)的處理方法（在此不詳述）。但目前任何處理的方法均對(duì)細(xì)胞有損傷，所以還應(yīng)著重污染的預(yù)防。
  3.細(xì)胞交叉污染及排除
   由于在細(xì)胞培養(yǎng)操作過程中，多種細(xì)胞培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行時(shí)，器材和培養(yǎng)用液混雜易導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。這種污染是細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性發(fā)生變化，某些變化不易察覺。導(dǎo)致細(xì)胞不純。
 防止交叉污染的措施主要有：器材做好專門標(biāo)記，培養(yǎng)液公用時(shí)，吸管使用分開！
   4.化學(xué)物質(zhì)污染及排除
   主要為殘存洗滌劑、細(xì)胞殘余、解體的微生物等。鼓細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用全部實(shí)驗(yàn)器材都要嚴(yán)格清洗。
   5.健康細(xì)胞與衰老細(xì)胞
    光鏡下生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞均質(zhì)、明亮、透明度大、折光性強(qiáng)，相差顯微鏡下可以看清細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)中有粗大的線粒體顆粒和核。在細(xì)胞衰老，機(jī)能不良時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中常出現(xiàn)黑色顆粒、空泡或脂滴，細(xì)胞間空隙加大，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則或失去原有特性。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
四.培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)檢查和鑒定
一旦培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)成為形態(tài)上單一的細(xì)胞群和細(xì)胞系（株）后，無論是使用它進(jìn)行研究工作，還是做建系（株）工作，都需要全面了解這些細(xì)胞的生物學(xué)特性。檢查項(xiàng)目一般有以下內(nèi)容：
 4.1細(xì)胞形態(tài)描述
用相差顯微鏡觀察活細(xì)胞并攝影，主要觀察細(xì)胞形態(tài)、大小、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小及多少等。采用蓋玻片條培養(yǎng)計(jì)數(shù)和Giemsa染色法，能簡(jiǎn)便快速地獲得細(xì)胞光鏡圖像特征與電技術(shù)結(jié)合，可獲得細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)圖像
 4.2細(xì)胞定性
  用于培養(yǎng)細(xì)胞的免疫標(biāo)志的定性方法有兩種：
  （1）免疫組化法 （2）透射電鏡法
4.3  細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細(xì)胞懸液。一般接種7~8組，每組三瓶（亦可用孔板）。每天檢查一組，每瓶計(jì)數(shù)4次，取平均值，再累計(jì)三瓶均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7~10天。**后用坐標(biāo)紙匯出逐日細(xì)胞數(shù)，即得細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞數(shù)量增加一倍的時(shí)間即細(xì)胞倍增時(shí)間。
4.4細(xì)胞分裂指數(shù)MI
細(xì)胞分裂指數(shù)是指1000個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞分裂相的數(shù)目。用以表示細(xì)胞增殖的旺盛程度。具體操作請(qǐng)參閱有關(guān)資料
   還有細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)、細(xì)胞DNA定量、細(xì)胞周期等
 
 
五.相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)：
 5.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)：
（1）計(jì)數(shù)板原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。
（2）操作步驟：每小組一塊計(jì)數(shù)板，及蓋玻片
① 將計(jì)數(shù)板及蓋玻片用酒精棉球擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板，放在鏡下觀察。
② 制備細(xì)胞懸液：將細(xì)胞從培養(yǎng)板孔或培養(yǎng)瓶中轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000轉(zhuǎn)4-5分鐘，棄去上清，加入PBS**一定體積（1ML）。
③ 將細(xì)胞懸液吸出少許（10ul）（可將需計(jì)數(shù)之細(xì)胞懸液先吸取0.5ml左右放在1.5mlEp管中，再拿離超凈臺(tái)計(jì)數(shù)），滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
④計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。
 
 ⑤公式計(jì)算：
細(xì)胞數(shù)/mL=四大格細(xì)胞總數(shù)/4×10⁴
說明：公式中除以4，因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。
公式中乘以10⁴因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：
1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm³ 而 1ml=1000mm³
 ⑥注意：鏡下偶見有兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說明分散不好，需重新稀釋制備細(xì)胞懸液
5.2臺(tái)盼蘭染色操作步驟：   
 ① 制備細(xì)胞懸液，放入EP管中。
 ② 以1：1的體積比例在上EP管中加入0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2_~3分鐘。
 ③ 吸取少許（一滴即可）懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
 ④ 鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。
           根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要請(qǐng)參閱相關(guān)方法
     懸浮細(xì)胞傳代及細(xì)胞計(jì)數(shù)
一、 細(xì)胞傳代
（一）實(shí)驗(yàn)用品：
1．儀器
　   凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、
倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱；
2．器皿
　 培養(yǎng)板（6孔，96孔）、培養(yǎng)瓶、玻璃長(zhǎng)吸管（彎頭、直頭）、載玻片、
　 槍頭tip、移液管、長(zhǎng)滴管膠塞、15ml離心管、離心管架、廢液缸、
3．其他物品
　 微量加樣器、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、蓋玻片、記號(hào)筆、
4．試劑
1640培養(yǎng)液、PBS等
（二）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>
掌握細(xì)胞計(jì)數(shù)及懸浮細(xì)胞傳代技術(shù)。
（三）實(shí)驗(yàn)原理：見前述
（四）本實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1.準(zhǔn)備：所有實(shí)驗(yàn)操作均在無菌環(huán)境下進(jìn)行，需提前30分鐘消毒環(huán)境
每小組8-9人用一操作臺(tái)。備96孔板一塊，15ml離心管數(shù)支，小平皿1塊，1.5ml Ep管一盒，長(zhǎng)玻璃滴管，加樣器及tip等
打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋（管蓋倒放于臺(tái)上）。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入1.5mlEp管（放于塑料試管架上）備用。
2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)之K562細(xì)胞，每組一瓶。放在顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)、密度。
      生長(zhǎng)狀態(tài)檢測(cè)：臺(tái)盼藍(lán)法
      取一滴滴于載玻片上，用臺(tái)盼藍(lán)染色（見方法），蓋上蓋玻片，鏡下觀察
3.觀察培養(yǎng)瓶孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出瓶中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入15ml塑料離心管中。再用另一支吸管吸取PBS量約2ml，加入培養(yǎng)瓶中，輕輕吹打瓶壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管中，大約總量為10ml左右。
4.離心，設(shè)置離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分，1-2分鐘，沉淀即可。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
5.取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管，輕輕吹打細(xì)胞，使之均勻懸浮后轉(zhuǎn)**小平皿中待分裝，注意不要污染！
6.吸取0.5―1ML細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入EP管中，備計(jì)數(shù)用（10ul加計(jì)數(shù)板）。
7.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察及細(xì)胞凍存
① 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線觀察
    96孔板一塊，細(xì)胞懸液分別放入96孔板孔中，每孔200ul。
  本實(shí)驗(yàn)觀察四天。見96孔板的一側(cè)標(biāo)記1,2,3,（代表第二、三、四天），按順序每排加6孔（即**有6孔），加三排。（注意未加懸液的空白孔要保證未污染，留作復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)用）（具體觀察方法見后）
② 細(xì)胞凍存
剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)入凍存管中，每組一管，具體方法見凍存操作。
8.鏡下觀察細(xì)胞是否分布均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
 
 
 二、細(xì)胞計(jì)數(shù)及生長(zhǎng)曲線測(cè)定
（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>
  1.能獨(dú)立的進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)操作，繪制生長(zhǎng)曲線，了解細(xì)胞生長(zhǎng)的發(fā)育特性。
  2.學(xué)習(xí)在科研中如何應(yīng)用生長(zhǎng)曲線
（二）實(shí)驗(yàn)原理：
  生長(zhǎng)曲線的測(cè)定（計(jì)數(shù)法）是測(cè)定細(xì)胞**生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，為培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過長(zhǎng)短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長(zhǎng)，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。
  為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過程中的細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，需連續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通常計(jì)數(shù)7天。為精確起見，一般每次計(jì)數(shù)三平行樣品（孔或瓶）細(xì)胞并取平均值。典型的生長(zhǎng)曲線可分為生長(zhǎng)緩慢的潛伏期，成平臺(tái)狀的平頂期及退化衰亡四個(gè)部分。以存活細(xì)胞數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間做圖，即生長(zhǎng)曲線。
  生長(zhǎng)曲線常用于測(cè)定藥物等外來因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。一般在對(duì)數(shù)期的1/3-1/2處加藥。細(xì)胞技術(shù)的時(shí)間和次數(shù)依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩ā?br />   另外，測(cè)定生長(zhǎng)曲線的常用方法還有MTT法。
（三）實(shí)驗(yàn)操作
細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制
①  每一小組（8-9人）   1 塊 96孔板
   ② 細(xì)胞懸液分孔前細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，為**天細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)
③ 傳代操作中已做。
96孔板一塊，細(xì)胞懸液分別放入96孔板孔中，每孔200ul。
  本實(shí)驗(yàn)觀察四天。見96孔板的一側(cè)標(biāo)記1,2,3, ,（代表第二、三、四天），按順序每排加6孔（即**有6孔），加三排。（注意未加懸液的空白孔要保證未污染，留作復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)用）
④第二天  分別吸取培養(yǎng)板中 **排中 4孔 分別計(jì)數(shù)，再將4孔細(xì)胞數(shù)平均。
記錄下數(shù)值，即為第二天細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
⑤第三天  重復(fù)昨天工作
⑥第四天 同 ④
 ⑦ 繪圖，了解細(xì)胞生長(zhǎng)情況，估計(jì)細(xì)胞倍增時(shí)間
 
 
。三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>：
（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的**主要目的。
（2）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。
（3）減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。
（4）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。
（5）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。
（二）實(shí)驗(yàn)用品：
  1.儀器
　　凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
  2.器皿
　　吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸；
　　吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）
  3.其他物品
　 微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、移液槍。
  4.試劑
 　 培養(yǎng)液、DMSO（分析純）
  K562細(xì)胞，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系中的一種。
（三）實(shí)驗(yàn)原理：
   細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以**大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
 
 
（四）操作步驟：所有操作均為無菌環(huán)境中，操作臺(tái)需提前三十分鐘常規(guī)消毒
1.哺乳動(dòng)物細(xì)胞凍存
1.1.準(zhǔn)備：打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。
1.2.配制凍存液：吸取9 ML培養(yǎng)液放入離心管，用移液槍吸取1ML DMSO溶液，逐滴緩慢加入離心管中。**好把離心管插在冰中。
1.3.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，放在顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)、密度。
1.4.觀察培養(yǎng)瓶孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出瓶中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入15ml塑料離心管中。再用另一支吸管吸取PBS量約2ml，加入培養(yǎng)瓶中，輕輕吹打瓶壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管中，大約總量為10ml左右。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
1.5.離心，設(shè)置離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分，1-2分鐘，沉淀即可。
1.6.取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管，輕輕吹打細(xì)胞，使之均勻懸浮。
1.7.吸取0.5-1ML細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入EP管中，備計(jì)數(shù)用（10ul加計(jì)數(shù)板）。
1.8.吸取1ML配制好的凍存液加入離心管，與細(xì)胞混勻后，轉(zhuǎn)入凍存管（每小組做1管）。
1.9.標(biāo)注：  標(biāo)明細(xì)胞種類、凍存日期，凍存人。
1.10在4℃冰箱中放置 30 分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20℃，放置30 分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80℃放置16－18 小時(shí)（或過夜）；**后放入液氮中長(zhǎng)期保存。有條件的地方，可用凍存盒。
1.11注意事項(xiàng)：
（1）凍存過程需緩慢
（2）凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90％，無微生物污染。
（3）細(xì)胞濃度控制在：1×10⁷－5×10⁷/ml。
（4）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，**常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為5－10％。但是，有些細(xì)胞系不能用DMSO作為冷凍保護(hù)劑，如人白血病細(xì)胞系HL-60。因?yàn)椋珼MSO 能誘導(dǎo)HL-60 細(xì)胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油（glycele）,羥乙基淀粉等。
（5）DMSO 稀釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。
 
 
2.哺乳動(dòng)物細(xì)胞復(fù)蘇
2.1.準(zhǔn)備工作
① 37℃水浴（保溫杯類物品）
②準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝5-10 ml 細(xì)胞完全培養(yǎng)液15ml離心管
③六孔板一塊（四小組可共用）
2.2.細(xì)胞復(fù)蘇操作
①帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，手持凍存管不斷搖動(dòng)。觀察完全解凍后移入超凈臺(tái)。冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。
②打開凍存管，迅速將細(xì)胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻。
③1000rpm離心數(shù)分鐘，棄去上清液。
④沉淀中加入適當(dāng)培養(yǎng)基，放入六孔板中37℃常規(guī)培養(yǎng)。
⑤第二天觀察生長(zhǎng)情況。
2.3.注意事項(xiàng)：
①解凍操作過程動(dòng)作要輕。由于冷凍保存過的細(xì)胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動(dòng)作要輕。
②解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，切不可直接用手，以免凍傷。