實驗目的：
學習并掌握細胞培養(yǎng)使用的器皿、器械的洗滌和消毒。
實驗用品：
1．儀器和用品：超凈工作臺、干燥箱、高壓鍋、過濾器、紫外燈、0.22μm/0.45μm微孔濾膜。
2．試劑：75%酒精、5%HCl、1‰新潔爾滅、重鉻酸鉀。
實驗內(nèi)容：
1．準備培養(yǎng)用血清瓶（PBS、培養(yǎng)基，約10套，包括20、50ml）、培養(yǎng)瓶（50個）、玻璃滴管（若干）、離心管（10ml）、EP管若干、不銹鋼濾器、膠塞、滴頭等。
2．分別包裝上述物品，其中血清瓶和瓶蓋分別包裝，玻璃吸管置于不銹鋼筒中、玻璃離心管、 EP管分別置于飯盒中。
3．將上述物品置于高壓滅菌鍋中進行消毒滅菌。
4．實驗室準備。
實驗步驟
（一） 清洗
1．玻璃器皿的清洗
浸泡  刷洗  浸酸  沖洗
（1）. 新購玻璃血清瓶先用洗衣粉洗，再以0.1-0.05 mol/l HCl 浸泡數(shù)小時，然后用鉻酸浸泡過夜，**后用自來水、一次與二次去離子水洗凈后才能開始使用。
（2）. 用過之玻璃血清瓶，用洗衣粉洗凈后鉻酸浸泡過夜，**后用自來水、用一次與二次去離子水沖洗干凈。
此外，玻璃器皿的瓶子的蓋子必須也泡鉻酸，培養(yǎng)瓶瓶蓋可以不用泡鉻酸，高溫滅菌的時候要擰上瓶蓋，留有一定的縫隙，滅菌后蓋緊。瓶蓋的上面應當用錫箔紙或者牛皮紙包住，用繩子扎緊
2．塑料器皿的清洗
自來水充分浸泡  沖洗  2%NaOH浸泡過夜  蒸餾水漂洗3次  2%-5%鹽酸浸泡30min   自來水沖洗   晾干  紫外線照射30min
3．膠塞等橡膠類的清洗
自來水沖洗  2%NaOH  煮沸15min 自來水沖洗 蒸餾水煮沸10min 自來水沖洗5次以上
2%-5%HCl煮沸15min  晾干  晾干后高壓滅菌
4．金屬器械的清洗
新購置的器械
用過的器械
（二）包 裝
分為局部包裝和全包裝。
為了防止消毒滅菌后再次遭受污染。
按照不同類別進行包裝。
（三）消毒滅菌
主要包括物理法和化學法。
  物理法：熱滅菌、蒸汽滅菌、濾過除菌、紫外線、熏蒸消毒、煮沸消毒。
 化學法：應用化學制品進行消毒滅菌。
（四）無菌室和操作野消毒
無菌室內(nèi)每周用乳酸蒸氣（或過氧乙酸）加紫外線消毒1-2次。實驗前，將實驗器材放入超凈臺內(nèi)，打開超凈臺紫外燈，同時啟動超凈臺風機，40min后消毒完畢，關閉紫外線燈。這樣，超凈臺內(nèi)空氣被凈化，超凈臺面構(gòu)成相對無菌的環(huán)境。
或無菌室：每周用75%酒精擦洗后紫外滅菌。

實驗 培養(yǎng)基的配制及細胞培養(yǎng)的條件

一、培養(yǎng)基的特性－細胞生存的環(huán)境與條件
1溫度條件（37 ＋0.5）
2 pH條件 （7.2-7.4）
3氣體條件
4水的質(zhì)量（三蒸）
5滲透壓
6營養(yǎng)條件
7無菌條件℃
二、 培養(yǎng)基的分類
1平衡鹽液
2天然培養(yǎng)基（小牛血清、胚胎液）
3合成培養(yǎng)基（化學成分清楚）
三、 RPMI1640培養(yǎng)基的配制
1、RPMI1640 10 g
2、丙酮酸鈉 0.11 g
3、Hepes（羥乙基哌碃乙硫磺酸） 5.925 g
4、NaHCO3  2 g
5、三蒸水 1000 mL
四、 過濾出菌
    儀器：不銹鋼正壓濾器
    材料：纖維素微孔慮膜 （0.22 mm 孔徑）
裝好后消毒
五、 完全培養(yǎng)基的配制
RPMI 1640 培養(yǎng)液   85 mL
小牛血清             10 mL
谷氨酰氨             1 mL
抗菌素（青、鏈霉素） 1萬單位 1 mL

實驗動物細胞連續(xù)傳代培養(yǎng)（SP2/0細胞）

一、實驗目的：
1、為細胞融合準備SP²/0小鼠骨髓瘤細胞；
2、雜交瘤細胞的擴大培養(yǎng)（種腹水），或傳代培養(yǎng)。
二、實驗原理：
小鼠骨髓效力細胞株（NSI，SP₂/0）和雜交瘤細胞均具有無限生長繁殖的能力，它們都屬于半貼壁細胞，不用胰蛋白酶或EDTA消化液，只需輕輕沖洗瓶壁上的細胞便可脫落。因而可以利用這些特性對這類細胞進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，以為實驗提供生長旺盛的細胞（對數(shù)生長期的細胞）。
三、實驗材料：
SP²/0細胞（或雜交瘤細胞）
CO₂培養(yǎng)箱、細胞培養(yǎng)瓶（25、50、100毫升）、彎頭滴管、消毒用套筒（玻璃或銅質(zhì)）、吸頭、RPMI-1640完全培養(yǎng)基、倒置顯微鏡、試管架、酒精燈、滅菌高壓鍋。
四、實驗步驟：
1、復蘇的或轉(zhuǎn)瓶的傳代細胞，使細胞濃度大約為5×10⁴/毫升，置37℃5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)48小時后，可見部分細胞貼壁生長，而部分細胞呈漂浮狀態(tài)，可用滴管吸去漂浮的細胞，加入少量新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時以上。
3、若細胞生長過密，則需及時沖下并吸出部分細胞，或?qū)⑽龅募毎D(zhuǎn)瓶擴大培養(yǎng)，如果不是這樣處理，細胞很易出現(xiàn)衰老、死亡現(xiàn)象，對于雜交瘤來講，這樣更易誘發(fā)陽性克隆丟失可能性。
4、用于細胞融合的骨髓細胞，必須在生長繁殖的對數(shù)期（約10⁵細胞/毫升），而且細胞形態(tài)規(guī)則要一致（圓而亮，有一定的立體感），機能要活躍，活細胞數(shù)在90—95%以上。要得到這種細胞，其培養(yǎng)技巧在于，在融合前24小時，將生長良好的細胞全部自瓶壁沖下來，并除去1/2或更多的細胞，加入新鮮培養(yǎng)液令細胞重新貼壁分裂增繁。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
5、作為長期在體外傳代培養(yǎng)的細胞，為減少工作量，可采用8—10%小牛血清的培養(yǎng)基，這樣細胞的繁殖速度亦慢，一般可間隔3天更換一次培養(yǎng)液。
6、本試驗要求各組將細胞自小瓶轉(zhuǎn)入中瓶再轉(zhuǎn)入較大的培養(yǎng)瓶中生長，并用對數(shù)增長期的細胞用于凍存和復蘇實驗（見實驗六）。
五、結(jié)果觀察：
1、細胞傳代前后的生長狀態(tài)及速度的觀察；
2、細胞轉(zhuǎn)瓶后生長情況觀察；
3、了解生長良好，一般及較差細胞的顯微鏡下觀察；
4、傳代細胞培養(yǎng)的體會。
六、注意事項：
1、連續(xù)細胞傳代培養(yǎng)更應注意無菌操作；
2、傳代時機對于細胞生長的狀況及速度十分重要，尤其要注意不能等細胞出現(xiàn)老化后再傳代，那樣做一般結(jié)果并不如愿；
3、傳代轉(zhuǎn)瓶時細胞量的取舍主要根據(jù)細胞量的多少，生長條件優(yōu)劣以及個人實踐經(jīng)驗而決定；
4、用于凍存、融合、傳代的細胞都要求是處于對數(shù)增長期的細胞，不能勉強 為之。
 

實驗   淋巴細胞雜交瘤的制備

一、實驗目的
1、系統(tǒng)了解淋巴細胞雜交瘤實驗技術的全部過程；
2、學會觀察與判別融合細胞的出現(xiàn)，并計算融合率。
二、實驗原理：
小鼠骨髓瘤可以在體外培養(yǎng)液中生存并大量繁殖。經(jīng)過用某種抗原免疫的小鼠及淋巴細胞能分泌某種抗體，但小鼠的B淋巴細胞在一般培養(yǎng)某中不易存活。
如將小鼠的骨髓瘤細胞與分泌霜種抗體的B淋巴細胞在融合因子（聚乙二醇，PEG）作用下產(chǎn)生融合，則融合的細胞既具有腫瘤細胞易分裂增殖的特性，又具有B淋巴細胞分泌特異性抗體的能力，在HAT選擇培養(yǎng)基中可以選擇得到雜交細胞。這種融合的被稱為淋巴細胞雜交瘤的細胞可以在體外培養(yǎng)液中大量繁殖生長，從培養(yǎng)液上清中可以收集到大量某B淋巴細胞產(chǎn)物——單克隆抗體。
三、實驗材料：
免疫的BALB/小鼠，SP2/O骨髓瘤細胞株，CO₂培養(yǎng)箱
超凈工作臺  倒置顯微鏡  光學顯微鏡   恒溫水箱
計數(shù)板、計數(shù)器、蓋玻片；  離心機  手提式自封消毒鍋  彎頭滴管
吸量管（1.0、0、5.0毫升） 注射器（5毫升，10毫升）  針頭（7^#）
細胞培養(yǎng)瓶  24孔、96孔培養(yǎng)板（天津產(chǎn)或進口） 酒精燈
120目鋼絲網(wǎng)
￠9cm平皿
50ml帶蓋塑料離心管
100毫升三角瓶、青毒素小瓶
燒杯（100，500，1000毫升）
微濾器1000毫升正壓不銹鋼濾器
微孔濾膜
眼科剪、鑷
脫脂棉、紗布、膠布、衛(wèi)生卷紙
HAT培養(yǎng)基
HT培養(yǎng)基
無血清培養(yǎng)基
15%小牛血清培養(yǎng)基
小牛血清
乙醇（AR，工業(yè)純）
C—PBS
四、培養(yǎng)基與試劑的配制：
1、RPMI-1640培養(yǎng)基的配制；
RPMI-1640粉 10.4g
丙酮酸鈉 0.11g
Hepes 5.925g
三蒸水 1000ml
磁力攪攔器攪攔3小時，溶解后過濾除菌，在4℃中保存。
2、200mML-谷氨酰胺的配制：
L-谷氨酰胺 1.461g
三蒸水 100ml
深解后，過濾除菌，分裝小瓶，每瓶1ml，在-20℃保存。
4.5%碳酸氫鈉（N_aHCO₃）配制
N_aHCO₃ 5g
三蒸水 100ml
8磅高壓滅菌15分鐘，在4℃保存。如分裝小瓶，每瓶4.2ml。
5、次黃嘌呤及胞腺嘧啶核苷（HT）100倍母液配制：
次黃嘌呤（Hypoxanthine，H）68.05mg
胞腺嘧啶核苷（Thymidine,T） 19.4mg
三蒸水 50ml
在45—50℃水浴中溶解，過濾除菌，分裝小試管中，每管1—5ml，在-20℃保存。
6、氨基碟呤（A）1.76mg
三蒸水 90ml
IN氫氧化鈉 0.5ml
溶解后，加入IN鹽酸0.5ml中和，補充蒸餾水**100ml
過濾除菌，分裝小試管內(nèi)，每管1—5ml，在-20℃保存。
7、無血清RPMI-1640 100ml
L-谷氨酰胺200nM（0.2） 1.0ml
抗菌素（青、鏈霉素各1萬單位） 1.0ml
5%碳酸氫鈉 4.2ml
8、RPMI-1640完全培養(yǎng)基配制
RPMI-1640完全培養(yǎng)液 100ml
L-谷氨酰胺200mM（0.2m） 1.0ml
青、鏈霉素（各1萬單位/ml） 1.0ml
5%碳酸鈉 4.2ml
小牛血清（滅活） 15ml
9、HAT培養(yǎng)基的配制：
RPMI-1640完全培養(yǎng)基 100ml
100倍HT母液 1.0ml
100倍A母液 0.8ml
10、HT培養(yǎng)基的配制
RPMI-1640完全培養(yǎng)基 100ml
100倍HT母液 1.0ml
11、50%（W/V）聚乙二醇（PEG）液的配制
PEG 10.0g
8磅15分鐘，或煮沸20分鐘滅菌并且融化，冷**50℃時加入。
RPMI-1640無血清培養(yǎng)基 10ml
混合均勻，分裝小試管內(nèi)，每管0.7ml，在-4℃中保存。
12、0.15MPH7.2枸櫞酸鈉-PBS配制：
NaCI 6.4g   KCI 0.16g  NaHPO₄·H₂O 2.32g   KH₂PO₄ 0.16g
枸櫞酸鈉 7.6g  二蒸水 1000ml
分裝在100ml瓶中，每瓶50—100ml，8磅15分鐘高壓滅菌后，在4℃保存。
13、20%二甲基亞礬（DMSO）細胞保存液的配制（按體積計算）：
小胎牛血清 5份
RPMI完全培養(yǎng)基 3份
二甲基亞礬（DMAO） 2份
混勻，在4℃保存，不必過濾除菌或高壓清毒二甲亞礬，因它也是有毒的以**于自身是無菌的。
14、8-氮鳥嘌呤100倍母液的配制#p#分頁標題#e#
8-氮鳥嘌呤 1 152mg#p#分頁標題#e#
0.36%NaHCO₂ 1.0ml
4N NaOH 100ml
三蒸水 100ml
過濾除菌，分裝小瓶，每瓶1.0ml，在-40℃保存。
15、0.1%伊文氏蘭液配制：
伊文氏蘭液（Fveng’s blue） 0.1g
0.15M PH7.2枸楷酸鈉-PBS 100ml
混勻，4℃保存，也可配制成1%溶液，保存，使用前再稀釋成0.1%。
五、實驗步驟：
1、取末次免疫后的第3天小鼠脾細胞懸液，將10⁸小鼠脾細胞與1-5×10⁷SO₂/O小鼠骨髓瘤細胞混合于50毫升刻度離心管中，經(jīng)1000轉(zhuǎn)/分離心7分鐘；
2、棄上清液，盡可能除得干凈，用手指輕叩離心管底部，使沉淀混勻如糊狀，離心管置37℃水中進行水?。ㄒ恍校?，準備融合；
3、將37℃水浴中保溫的50%PEG1.0毫升（實際應用0.7毫升）用滴管緩慢滴入離心管中，在60秒鐘內(nèi)滴完，在37℃水浴中邊滴邊搖邊離心管，使細胞保存在混勻狀態(tài)；
4、加完PEG后，將細胞懸液放在37℃水浴中靜置90秒鐘，立即在2—4分鐘內(nèi)加入15毫升無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（37℃），開始要一滴一滴地加，由于稀釋使PEG停止作用。注意盡可能不攪動細胞；
5、再經(jīng)100轉(zhuǎn)/分離心10分鐘。棄去上清液，加25毫升HAT培養(yǎng)液，輕輕混勻，將混懸液分裝已有巨噬細胞的兩個24孔培養(yǎng)板中，每孔0.5毫升；
6、將培養(yǎng)板放在水蒸汽飽和CO₂孵箱中，37℃孵育。CO₂含量為5%；
7、每2—3天換一次HAT培養(yǎng)液，連續(xù)2周觀察雜交瘤細胞是否出現(xiàn)。2周后使用HT培養(yǎng)基。
六、注意事項：
1、細胞雜交瘤的實驗全過程必須是在嚴格的無菌條件下進行，任何一個環(huán)節(jié)的疏忽均可導致嚴重污染。因而須嚴格的無菌操作。
2、試劑價格相對昂貴，應注意節(jié)省。
3、試驗中的各個環(huán)節(jié)，尤其是結(jié)細胞融合過程和細胞克隆的篩選工作更為重視。

實驗 細胞克隆化培養(yǎng)技術—有限稀釋法

一、實驗目的：
1、掌握用有限稀釋法進行細胞克隆化培養(yǎng)技術；
2、學會細胞克隆形成的辯觀察技能；
3、配合抗體分泌細胞篩選技術，確定抗體分泌細胞。
二、實驗原理：
克隆化培養(yǎng)即單細胞培養(yǎng)技術，用有限稀釋法進行雜交瘤細胞克隆化培養(yǎng)，可以及時確定陽性雜交瘤細胞株，同時淘汰因發(fā)生染色體丟失或抗體的輕、重鏈基因分離而出現(xiàn)無抗體分泌陰性細胞株。
一般雜交瘤細胞需經(jīng)過52—3次反復克隆后，才能達到100%細胞陽性率。
該辦法亦適用于一般細胞培養(yǎng)中的細胞純化、突變細胞株的選擇，識別和分離。是細胞株的常用方法。
三、實驗材料：
雜交瘤細胞、25毫升培養(yǎng)瓶、96孔細胞培養(yǎng)板（天津有機玻璃廠）、移液管（1毫升、5毫升、10毫升）、彎頭滴管、倒置顯微鏡、CO₂培養(yǎng)箱、白細胞計數(shù)板、計數(shù)器、蓋玻片、防水筆、RPMI-1640、小牛血清、青鏈霉素、10毫升刻度離心管，00橡膠塞，飼養(yǎng)細胞（3-6×10⁵/ml、見腹腔細胞的制備）。
四、實驗步驟：
1、分裝了每孔0.1毫升腹腔細胞的96孔細胞培養(yǎng)板（可提前24小時準備就緒，置CO₂培養(yǎng)箱中備用）；
2、自細胞培養(yǎng)瓶中收集長勢良好的雜交瘤細胞（亦可自24孔培養(yǎng)板孔中收集），制成懸液。
3、按白細胞計數(shù)方法準確計得細胞懸液的細胞數(shù)，一般在10⁵/毫升左右。
4、取3支10毫升刻度離心管排列在超凈工作臺試管架上，先用無血清培養(yǎng)基將細胞稀釋**10³/毫升，再用含15%小牛血清的完全培養(yǎng)基稀釋到10¹/毫升細胞，即每0.1毫升1個細胞。
5、每孔0.1毫升細胞懸液。
6、置37℃5%CO₂培養(yǎng)箱，4天后取出觀察，并在板蓋上打上標記，做好記錄并統(tǒng)計結(jié)果。
7、繼續(xù)培養(yǎng)時，則在第4-5天更換1/2培養(yǎng)基，約第7-9天可以收獲培養(yǎng)液上清用于檢測抗體。并重復檢測1-2次。
8、選擇單克隆生長孔，生長良好，陽性強者，轉(zhuǎn)移到24孔板再做克隆經(jīng)培養(yǎng)或擴大培養(yǎng)。
五、實驗結(jié)果：
實驗結(jié)果以總細胞孔（如96孔）中出現(xiàn)克隆孔統(tǒng)計出克隆百分率，并可進一步按單細胞孔、雙細胞孔、多細胞孔分別計算出百分率。
六、注意事項：
1、注意無菌操作，一旦發(fā)現(xiàn)污染（孔）必須及時處理；
2、計數(shù)細胞要求準確，稀釋量亦要準確，否則將造成一孔多細胞克隆或克隆百分離太低；
3、在計數(shù)克隆出現(xiàn)率之前，不宜更換培養(yǎng)液，也不宜強烈振動培養(yǎng)板；
4、做克隆化培養(yǎng)的小牛血清必須是優(yōu)質(zhì)血清；
5、若做克隆抗體檢測時，特別要保護細胞的生長狀況，防止細胞生長不良甚**丟失。
七、說明：
哺乳動物細胞通過分離、稀釋接種，培養(yǎng)在適宜于單細胞生長的培養(yǎng)液中，形成細胞克隆。運用這項技術可以制作細胞成活曲線，即在接種相同數(shù)量細胞的培養(yǎng)瓶中，加入不同濃度的化學藥品，或照以不同劑量的射線，觀察其對細胞的聽見害程度。由此可以在哺乳類細胞中進行誘變試驗及分離突變細胞。

實驗 雜交瘤細胞的冷凍保存和復蘇技術

一、目的：
掌握凍存和復蘇細胞的技術
雜交瘤細胞株一經(jīng)建立應盡快凍存，以保證雜交瘤細胞不**于因傳代污染或因變異而丟失，在克隆化前將抗體陽性的樣本凍存，在一旦克隆傳代失敗或在增殖過程中丟失，還可將保存的雜交瘤細胞重新復蘇，繼續(xù)進行實驗。將細胞凍存還可避免繁重的細胞傳代工作量以及不明原因的污染和細胞在培養(yǎng)過程中的變異。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
用于細胞融合的骨髓細胞株也可同樣方法保存：以取得穩(wěn)定可靠的親本細胞來源。因此，冷凍保存細胞株是雜交瘤研究的一項重要的實驗技術。
該技術同樣適用于一般動物細胞的冷凍和保存。
二、原理：
主要是城保護下，降低保存溫度甚**用深低溫（—196）保存，借以減低或幾乎停止細胞的活力的能量產(chǎn)生機構(gòu)，從而延長保存期。
冷凍保護劑有許多種類，而較普遍采用的是二甲基亞礬（Demathy,Sulfoxide,DMSO）它的作用既能降低細胞的新陳代謝，又能維護細胞膜的強度，使水分不易進入細胞而影響其冷凍保存。
三、試劑、器材：
1640完全培養(yǎng)基，10%DMSO-1640完全培養(yǎng)基，無血清1640培養(yǎng)基。
恒溫水浴、液氮罐、玻璃安瓶或帶密封蓋的塑料小管，裝安瓶的小布袋，刻度離心管，膠塞、培養(yǎng)或小培養(yǎng)瓶、小燒杯、細胞計數(shù)用器材。
四、操作方法：
1、細胞懸液配制：取生長旺盛、形態(tài)良好的待凍存細胞，用離心法收集細胞，并用凍存培養(yǎng)基將細胞調(diào)**3-5×10⁶/ml。
2、分裝：將細胞懸液注入2ml安瓶中或塑冷凍管中，每支0.5—1.0ml，封緊（安瓶用火焰封口），每只安瓶上標上細胞名稱、凍存日期、裝入小布袋中。
3、緩慢降溫，原則上要使凍存細胞瓶的溫度每分鐘下降1℃，待降**-60℃-70℃時，再將細胞浸沒有液氮中，各實驗室的操作方法根據(jù)細胞的種類和經(jīng)驗略有不同，以下兩法均可使用。
①將細胞管先放置4℃或普通冰箱冰格內(nèi)2小時，再移**液氮容器面上，停留30分鐘后（約-60℃-70℃），再浸入液氮中。
②將細胞瓶放入壁厚1—2cm的聚乙烯泡沫塑料盒中（自制），密封后，放在—80℃冰箱中過夜，次日將細胞瓶移**液氮中。
亦有人將安瓶放在4℃冰箱中4小時，再置安瓶于氣態(tài)氮中20分鐘，然后立即放入液態(tài)氮中。
五、細胞復蘇：
1、從液氮罐中取出安瓶或其它類型塑料冷凍管，有時冷凍管因未封嚴，浸入液氮后，取出后安瓶或管子內(nèi)液迅速氣化可以爆炸（力量有限）因此應戴手套和防護眼鏡。
2、迅速放入裝有37℃-40℃的熱水燒杯中（放在超凈工作臺內(nèi)），用鑷子夾緊并不時搖動，令盡快融化。
3、如用安瓶冷存，取出后，用70℃酒精擦試消毒后。折斷頸部，如用塑料管，則防止融融時滲入水，打開蓋子，用吸管吸出懸液，注入離心管中，再補加10毫升培養(yǎng)液（滴加）；或直接滴入裝有10ml培養(yǎng)液中（可以用無血清培養(yǎng)液）。
4、低速離心（1000轉(zhuǎn)/分）5-7分鐘，去上清，一般不再重復用培養(yǎng)液洗一次。
5、用培養(yǎng)液適當稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶中或24孔培養(yǎng)板中37℃5%CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。
6、以后仍按常規(guī)傳代培養(yǎng)進行培養(yǎng)。
注意事項：
1、安瓶或管內(nèi)凍存的細胞數(shù)量要充分，在融解后能允許做1：10-1：20的稀釋，**后細胞數(shù)量/毫升仍要比一般高一些，一般再培養(yǎng)接種濃度為5×10⁴/毫升，因此凍存細胞密度應達到10⁷毫升，在融后稀釋20倍后，仍能保持5×10⁵/毫升數(shù)量。
2、加入一定量的飼養(yǎng)細胞有助于復蘇細胞成活，飼養(yǎng)細胞的密度一般10⁵/毫升左右。
3、一般復蘇細胞的成活率在20—70%左右。
實驗  百合鱗莖培養(yǎng)
    一、目的要求
    百合在生產(chǎn)上存在著三個亟待解決的問題：一是用種量很大，每667m²百合按常規(guī)栽培，需用種250kg左右；二是繁殖系數(shù)低，每667m²只能收獲1 000kg左右；三是難以進行有性繁殖。因而采用組織培養(yǎng)方法對百合進行快速無性繁殖很有前途。本實驗的目的是學習和掌握百合鱗莖培養(yǎng)的基本方法和技術。
    二、材料、儀器與試劑
    1．材料：百合。
    2．儀器：超凈工作臺(或無菌箱)、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、長把鑷子、燒杯(500m1)、9cm培養(yǎng)皿、移液管等。
    3．試劑：①MS培養(yǎng)基，并附加NAA(或2，4-D及IBA)0．5～1．0mg／L和BA(或KT)0．1～1．Omg／L；②75％酒精；③O．1％升汞。
    三、方法步驟
    1．外植體消毒。取健康的百合鱗片，先用洗滌劑清洗干凈，再用75％酒精消毒30s和0．1％升汞消毒30min左右，**好加一點吐溫以得到良好的消毒效果，再用無菌水沖洗3次。較大鱗片可切成小切塊以備接種。
    2．外植體的接種和培養(yǎng)。將消毒后的鱗片小切塊，在無菌條件下直接接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)室溫度一般為25℃±1℃，每天用日光燈照射lOh左右。光照度為1 000～1 5001x。
    3．培養(yǎng)基的選用。培養(yǎng)基一般以MS培養(yǎng)基為主，只要附加適當?shù)闹参锷L物質(zhì)即可。生長素一般用NAA(或2，4-D及IBA)0．5～1．0mg／L。細胞分裂素一般用BA(或KT)0．1～1．0mg／L。為了促進根系和增加鱗莖重量，可考慮光暗交替培養(yǎng)和適當增加生長素的濃度。
    4．試管苗的誘導。
    (1)由鱗片小切塊誘導成苗。鱗片小切塊接種后，一般先分化出黃綠色或綠色的球形突起的小芽點，繼而芽點逐漸增大長成小鱗莖，并可生長出葉片，形成苗叢，生根后即可以從試管(或三角瓶)中取出，移栽于營養(yǎng)缽或大田。也可將小鱗莖繼代培養(yǎng)擴大繁殖。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
    (2)由葉片誘導成苗。用鱗片小切塊誘導分化出的苗叢，在超凈臺上取其無菌葉片，接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)半個月后即可分化出帶根的小鱗莖。培養(yǎng)兩個月后，每個單葉片形成的小鱗莖一般又可分化出帶有根系的叢生小鱗莖4～6個。葉片培養(yǎng)可直接插入培養(yǎng)基中，但要注意極性，不可倒置。葉片也可平放于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
    (3)由無菌小鱗片誘導成苗。利用試管中的無菌小鱗莖，在超凈臺上將小鱗片逐片接種于培養(yǎng)基中(鱗片基部向下或內(nèi)側(cè)面向上)。培養(yǎng)半個月左右即可開始分化，培養(yǎng)一個月左右即可分化出小鱗莖和根系，培養(yǎng)兩個月后，每個小鱗片一般又可分化出帶有根系的叢生小鱗莖4～6個。
    (4)由愈傷組織誘導成苗。上述外植體在分化成苗的過程中，常常也可伴隨著增殖具有顆粒狀似胚性細胞團的愈傷組織。該愈傷組織在連續(xù)不斷的繼代培養(yǎng)中，一方面繼續(xù)不斷地增殖相似的愈傷組織，另一方面又不斷地分化成苗。一般每個試管里的愈傷組織可分化成苗20～40個。這樣即可周而復始地分化出大量的試管苗。
    四、實訓報告
    寫出該實訓的報告。
實驗 大蒜葉片培養(yǎng)
一、目的要求
    目前大蒜生產(chǎn)上存在的主要問題是病毒造成的品種退化，使產(chǎn)量降低。為了克服病毒的侵染，采用莖尖培養(yǎng)進行脫毒和快繁。本實驗的目的是學習和掌握大蒜葉片培養(yǎng)的基本方法和技術，為大蒜莖尖培養(yǎng)奠定基礎。
    二、材料、儀器與試劑
    1．材料食用大蒜。
    2．儀器  超凈工作臺(或無菌箱)、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、長把鑷子、燒杯(500m1)、9cm培養(yǎng)皿、移液管等。
    3．試劑  ①MS_l培養(yǎng)基：MS+500mg／L水解乳蛋白、1 000mg／L酵母提取物、2mg／L 2，4-D；②MS₂培養(yǎng)基：MS+6-BA 2mg／L+NAA 0．01mg／L；③MsS₃培養(yǎng)基：MS+6-BA 2mg／L+IAA 0．05mg／L；④MS₄培養(yǎng)基：MS+KT0．5mg／L+6-BA 0．05mg／L十IAA 5mg／L+酵母提取物800mg／L。
    三、方法步驟
    1．以食用大蒜的未經(jīng)萌動的肉質(zhì)、瓣狀小鱗莖為材料，在無菌條件下去掉保護葉，用刀片將貯藏葉切成長、寬和深度各約為3mm的小塊。然后接種于MS_l培養(yǎng)基上，誘導愈傷組織。
    2．培養(yǎng)3d后，就有少數(shù)外植體開始膨大，10d有愈傷組織出現(xiàn)。其后，在愈傷組織表面產(chǎn)生大量光滑的小球體。
    3．將愈傷組織轉(zhuǎn)移到去掉2，4-D的分化培養(yǎng)基上，經(jīng)一個月左右可分化出苗，其中以MS₂及MsS₃培養(yǎng)基配方**好，苗的分化頻率可達80％以上。在生長素較高的MS₄培養(yǎng)基上，一個月后，不僅有苗分化，而且還可分化出根。
    四、實訓報告
    寫出該實訓的報告，并比較3種分化培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果。
實驗  蘋果胚培養(yǎng)
    一、目的要求
    掌握胚培養(yǎng)的基本過程，學會種子胚的剝離方法。
    二、材料與用具
    1．材料：①經(jīng)層積處理成熟飽滿的蘋果種子；②MS培養(yǎng)基。
    2．儀器：超凈工作臺，高壓蒸汽滅菌鍋，烘箱，光照培養(yǎng)箱或恒溫室，酸度計或pH試紙，電子天平，微量吸液管若干，雙筒解剖鏡，漏斗直徑6～8cm和12～14cm的各兩只，500ml和1 000ml試劑瓶若干只，培養(yǎng)皿(直徑6～9cm)若干，燒杯(50ml、100ml、500ml、1 000m1)各兩只，容量瓶或量筒(10ml、50ml、100ml、1 000m1)各2只，三角瓶(100m1)50～100只，酒精燈，玻璃框架2個，玻璃棒若干，棉花塞，牛皮紙，稱量紙，鋁箔，線繩，牛皮筋，剪刀，解剖刀，鑷子，接種針，濾紙，研缽等。
    3．試劑：MS大量元素母液，MS微量元素母液，MS鐵鹽母液，MS有機物母液，各種植物生長物質(zhì)貯備液，蔗糖，瓊脂，1mol NaOH溶液，1mol HCl溶液，次氯酸鈉溶液， 95％乙醇。
    三、方法步驟
    1．配制培養(yǎng)基。配制MS培養(yǎng)基1L，分裝**50只小三角瓶中，用棉花塞、牛皮紙封口，并包扎?；?qū)X箔裁成小片，封口。高壓蒸汽滅菌后備用。
  2．材料與消毒。將經(jīng)層積處理成熟飽滿的蘋果種子在蒸餾水中浸泡12h，用70％的乙醇浸泡消毒10s，然后用12％～14％的次氯酸鈉滅菌15min，經(jīng)無菌水沖洗3次后，鋪在經(jīng)高壓滅菌的1％瓊脂上。70d后剔除生根的種子，剩下的種子消毒后分離胚組織。
    3．器械消毒。先將玻璃棒在酒精燈火焰上滅菌。然后將解剖刀、解剖針和鑷子的先端放在95％的乙醇中蘸一下，再在酒精燈火焰上灼燒滅菌，逐一將它們放在玻璃棒上冷卻，待用。
    4．種胚剝離培養(yǎng)。將一粒種子放在無菌培養(yǎng)皿中，用鑷子夾住，用解剖刀先將種皮劃破，再用另一把鑷子輕輕把種皮剝?nèi)ィ媒馄实堆嘏咛サ倪吘壭⌒膭冸x胚乳。分離出胚后，用無菌蒸餾水將每一個胚胎沖洗3次，然后移人裝有培養(yǎng)基的三角瓶中。將接有胚的三角瓶放人黑暗中培養(yǎng)，保持溫度25℃。培養(yǎng)3～4d后，轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)。觀察其生長狀況。
    5．試管苗移栽。待苗長成后，將苗從培養(yǎng)瓶中小心夾出，洗去培養(yǎng)基，移入營養(yǎng)缽中，栽于經(jīng)過干熱滅菌處理的蛭石內(nèi)，溫度保持在25℃。蓋上塑料薄膜保溫、保濕，移入日光溫室進行馴化。一周后打開一個3～5mm的小縫，以后每天加寬通風縫，直**揭去塑料薄膜。當長出新葉時，即可移人大田。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
    四、實訓報告
觀察胚的生長變化，做詳細記錄。
實驗 胡蘿卜離體根培養(yǎng)
    一、目的要求
胡蘿卜是細胞和組織培養(yǎng)中的經(jīng)典材料，來源方便。是教學實驗的良好材料。本實驗的目的是學習胡蘿卜離體根培養(yǎng)的基本方法和步驟，學會和掌握誘導愈傷組織的基本技術。
二、材料、儀器與試劑
    1．材料  市售大而新鮮的胡蘿卜。
    2．儀器  超凈工作臺(或無菌箱)、滅菌鍋、顯微鏡、解剖刀、刮皮刀(蔬菜用具)、不銹鋼打孔器、長把鑷子、燒杯(500m1)、9cm培養(yǎng)皿、移液管等。
    3．試劑①MS培養(yǎng)基(配法見有關章)，并附加10mg／L 2，4-D和2mg／L -BA；②70％乙醇，飽和漂白粉溶液；00．05％甲苯胺藍(Toluidine blue 0)。
    三、方法步驟
    1．將胡蘿卜用自來水沖洗干凈，用刮皮刀除去表皮1--2mm，橫切成大約10mm厚的切片。以下步驟全部在無菌條件下操作。
    2．胡蘿卜片經(jīng)70％乙醇處理幾秒鐘后，無菌水沖洗一遍，再用飽和漂白粉溶液浸泡10min，無菌水沖洗3～4次。
    3．將胡蘿卜片平放于培養(yǎng)皿中，一手用鑷子固定胡蘿卜片，一手用打孔器按平行于組織片垂直軸方向打孔。每個小孔應打在靠近維管形成層的區(qū)域，務必打穿組織。然后從組織片中抽出打孔器，用玻棒輕輕將圓柱體從打孔器中推出，收集在裝有無菌水的培養(yǎng)皿中。重復打孔步驟，直**制備足夠數(shù)量的組織圓柱體。
    4．用鑷子取出圓柱體，放入培養(yǎng)皿中，用刀片切除圓柱體兩端各2mm長的組織。將剩下的組織切成3個各約2mm厚的小圓片(此時，小圓片直徑5mm，厚2mm)，將制備好的小圓片轉(zhuǎn)移到裝有無菌水的培養(yǎng)皿中。在整個切割操作中要多次火焰消毒鑷子和解剖刀，冷卻后再使用。
    5．用鑷子將圓片轉(zhuǎn)到滅菌的濾紙上(每次一片)，將圓片兩面的水分吸干，并立即植到培養(yǎng)基表面。注意接種時使三角瓶成一定的傾斜度，用手拿鑷子的接種過程不要直接在培養(yǎng)基上方完成，以減少污染機會。
    6．將培養(yǎng)物置于25℃溫箱中培養(yǎng)。也可將一部分放到光下培養(yǎng)，以比較光下和暗處對誘導愈傷組織的反應。
    四、實訓報告
    1．結(jié)果及觀察培養(yǎng)幾天后，外植體表面開始變得粗糙，有許多光亮點出現(xiàn)，這是愈傷組織開始形成的癥狀。經(jīng)數(shù)周培養(yǎng)后，將長大的愈傷組織切成小塊轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。用放大鏡觀察愈傷組織表面特征。用解剖針挑取一些細胞置于玻片上，加一滴水，壓上蓋片，在顯微鏡下觀察愈傷組織細胞的特征。也可經(jīng)甲苯胺藍染色后再行觀察。
    2．作業(yè)  寫出實訓報告。