1．間充質干細胞MSC基本形態
體外培養細胞根據它們在培養器皿是否能貼附于支持物上生長特征，可分為貼附型生長細胞，常表現為成纖維型細胞和上皮細胞。懸浮型細胞在培養中懸浮生長。
間充質干細胞MSC基本形態：形態與成纖維細胞類似，細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長，細胞中央有卵圓形核，胞質向外伸出2－3 厘米個長短不同的突起。可看到細胞成螺旋狀生長。
2．干細胞應用與干細胞調控
干細胞的調控是指給出適當的因子條件，對干細胞的增殖和分化進行調控，使之向指定的方向發展。
2.1內源性調控
干細胞自身有許多調控因子可對外界信號起反應從而調節其增殖和分化，包括調節細胞不對稱分裂的蛋白，控制基因表達的核因子等。另外，干細胞在終末分化之前所進行的分裂次數也受到細胞內調控因子的制約。
（1）胞內蛋白對干細胞分裂的調控
干細胞分裂可能產生新的干細胞或分化的功能細胞。這種分化的不對稱是由于細胞本身成分的不均等分配和周圍環境的作用造成的。細胞的結構蛋白，特別是細胞骨架成分對細胞的發育非常重要。如在果蠅卵巢中，調控干細胞不對稱分裂的是一種稱為收縮體的細胞器，包含有許多調節蛋白，如膜收縮蛋白和細胞周期素A。收縮體與紡錘體的結合決定了干細胞分裂的部位，從而把維持干細胞性狀所必需的成分保留在子代干細胞中。
（2）轉錄因子的調控
在脊椎動物中，轉錄因子對干細胞分化的調節非常重要。比如在胚胎干細胞的發生中，轉錄因子Oct4 是必需的。Oct4 是一種哺乳動物早期胚胎細胞表達的轉錄因子，它誘導表達的靶基因產物是FGF-4 等生長因子，能夠通過生長因子的旁分泌作用調節干細胞以及周圍滋養層的進一步分化。Oct4 缺失突變的胚胎只能發育到囊胚期，其內部細胞不能發育成內層細胞團。另外白血病抑制因子（LIF）對培養的小鼠ES 細胞的自我更新有促進作用，而對人的成體干細胞無作用，說明不同種屬間的轉錄調控是不完全一致的。又如 Tcf/Lef 轉錄因子家族對上皮干細胞的分化非常重要。Tcf/Lef 是Wnt 信號通路的中間介質，當與β-Catenin 形成轉錄復合物后，促使角質細胞轉化為多能狀態并分化為毛囊。
2.2外源性調控
除內源性調控外，干細胞的分化還可受到其周圍組織及細胞外基質等外源性因素的影響。
（1）分泌因子
間質細胞能夠分泌許多因子，維持干細胞的增殖，分化和存活。有兩類因子在不同組織甚**不同種屬中都發揮重要作用，它們是TGFβ家族和Wnt 信號通路。比如TGF 家族中**少有兩個成員能夠調節神經嵴干細胞的分化。**近研究發現，膠質細胞衍生的神經營養因子（GDNF）不僅能夠促進多種神經元的存活和分化，還對精原細胞的再生和分化有決定作用。GDNF 缺失的小鼠表現為干細胞數量的減少，而 GDNF的過度表達導致未分化的精原細胞的累積。Wnts 的作用機制是通過阻止β-Catenin 分解從而激活Tcf/Lef 介導的轉錄，促進干細胞的分化。比如在線蟲卵裂球的分裂中，鄰近細胞誘導的Wnt 信號通路能夠控制紡錘體的起始點和內胚層的分化。
（2）膜蛋白介導的細胞間的相互作用
有些信號是通過細胞-細胞的直接接觸起作用的。β-Catenin 就是一種介導細胞粘附連接的結構成分。除此之外，穿膜蛋白Notch 及其配體Delta 或Jagged 也對干細胞分化有重要影響。在果蠅的感覺器官前體細胞，脊椎動物的胚胎及成年組織包括視網膜神經上皮、骨骼肌和血液系統中，Notch 信號都起著非常重要的作用。當Notch 與其配體結合時，干細胞進行非分化性增殖；當Notch 活性被抑制時，干細胞進入分化程序，發育為功能細胞。
（3）整合素（Integrin）與細胞外基質
整合素家族是介導干細胞與細胞外基質粘附的**主要的分子。整合素與其配體的相互作用為干細胞的非分化增殖提供了適當的微環境。比如當β1整合素喪失功能時，上皮干細胞逃脫了微環境的制約，分化成角質細胞。此外細胞外基質通過調節β1整合素的表達和激活，從而影響干細胞的分布和分化方向。
2.3干細胞的可塑性
越來越多的證據表明，當成體干細胞被移植入受體中，它們表現出很強的可塑性。通常情況下，供體的干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。而在某些情況下干細胞的分化并不遵循這種規律。1999 年 Goodell 等人分離出小鼠的肌肉干細胞，體外培養 5 天后，與少量的骨髓間質細胞一起移植入接受致死量輻射的小鼠中，結果發現肌肉干細胞會分化為各種血細胞系。這種現象被稱為干細胞的橫向分化（trans-differentiation ）。關于橫向分化的調控機制目前還不清楚。大多數觀點認為干細胞的分化與微環境密切相關。可能的機制是，干細胞進入新的微環境后，對分化信號的反應受到周圍正在進行分化的細胞的影響，從而對新的微環境中的調節信號做出反應。
3．間充質干細胞MSC生長過程
潛伏期→指數增生期→停滯期
（1）潛伏期(latent phase) 細胞接種后,先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時,細胞質回縮, 胞體呈圓球形，然后細胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結束。細胞貼壁速度與細胞種類, 培養基成分,載體的理化性質等密切相關。一般情況下，原代培養細胞貼壁速度慢,可達10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常10-30分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期。原代培養細胞潛伏期長，約24-96 小時或更長, 連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需6-24 小時。 #p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
（2）指數增生期(logarithmic growth phase)
這是細胞增殖**旺盛的階段，分裂相細胞增多。指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數（Mitotic index, MI ）表示，即細胞群中每1000 個細胞中的分裂相數。一般細胞的分裂指數介于 0.1%-0.5% ，原代細胞分裂指數較低，而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達3％－5％。指數增生期的細胞活力**好時期，是進行各種實驗**佳時期，也是凍存細胞的**好時機。在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續 3－5 天后，隨著細胞數量不斷增多、生長空間減少，**后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現象稱接觸抑制現象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象，能繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積（piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖然發生接觸抑制，但只要營養充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數仍然在增多。但是，當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養枯竭和代謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現象稱密度抑制現象（Density Inhibition）。
（3）停滯期(Stagnate phase) 細胞數量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時細胞數持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進行分離傳代，細胞會因培養液中營養耗盡、代謝產物積聚、pH 下降等因素中毒，出現形態改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發生死亡，因此，應及時傳代。
4．間充質干細胞MSC培養的合適氣體環境
干細胞相關的培養液都必須在 5％ CO2 的氣體環境中培養使用。否則會對細胞產生影響。氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。開放培養時一般把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中。二氧化碳既是細胞代謝產物也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的pH 值。大多數細胞的適宜pH 為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養將產生有害的影響。一般情況下，細胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環境中更利于細胞生長。
5．細胞培養板的選擇
細胞培養板依底部形狀的不同可分為平底和圓底（U 型和V 型）；培養孔的孔數有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根據材質的不同有Terasaki 板和普通細胞培養板。具體選擇時根據培養細胞的類型、所需培養體積及不同的實驗目的而定。
（1）平底和圓底（U 型和V 型）培養板的區別和選擇
不同形狀的培養板有不同用途。培養細胞，通常是選用平底的，這樣便于鏡下觀測、有明確的底面積、細胞培養液面高度相對一致。因此做MTT 等實驗時，無論是貼壁和懸浮細胞，一般選用平底板。測吸光值一定要使用平底的培養板。要特別注意材質，標示“Tissue Culture (TC) Treated”是養細胞用的。 U 型或V 型板，一般在某些特殊要求時才使用。如在免疫學方面，當做兩種不同淋巴細胞混合培養時，需要二者相互接觸刺激，這時一般會選用U 型板，因為細胞會由于重力的作用而聚集在很小的范圍內內。圓底培養板還會用于同位素摻入的實驗，需要用細胞收集儀收集細胞的培養，如“混合淋巴細胞培養”等。V型板常用做細胞殺傷、免疫學血凝集實驗。細胞殺傷這種實驗也可用U 型板替代（加入細胞后，低速離心)。
（2）Terasaki 板和普通細胞培養板的區別
Terasaki plate主要是用于晶體學研究，產品設計便于對晶體的觀察與結構分析。有兩種 sitting 和 handing drop 兩種方法，兩種方法應用產品的外形結構也不同。材料上選擇crystal class polymer ，特殊的材料有利觀察晶體結構。細胞培養板主要是PS 材料，材料是treated sufface，便于細胞貼壁生長與伸展。當然還有浮游細胞的生長材料，同時還有low binding surface
（3）細胞培養板與酶標板的區別
酶標板一般要比細胞培養板貴，細胞板主要做細胞培養，也可以用來測蛋白濃度；酶標板包括包被板和反應板，一般不用做細胞培養，它主要做免疫酶聯反應后的蛋白檢測，需要更高的要求和特定的酶標工作液。
（4 ）常用不同培養板的孔底面積及推薦加液量
不同孔板所加培養液的液面都不宜太深，一般在2~3mm 范圍，結合不同孔的底面積就可算出各培養孔的適宜加液量（參考下表）。若加液量過多會影響氣體（氧氣）交換，而且在搬動過程中易溢出造成污染。具體所加細胞密度依實驗的目的不同靈活掌握。
常用的培養器皿
|
培養器皿 |
底面積（cm2） |
加培養液量（mL） |
可獲細胞量 |
|
96 孔培養板 |
0.32 |
0.1 |
105#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e# |
|
24 孔培養板 |
2 |
1.0 |
5×105 |
|
12 孔培養板 |
4.5 |
2.0 |
106 |
|
6 孔培養板 |
9.6 |
2.5 |
2.5×106 |
|
4 孔培養板 |
28 |
5.0 |
7×106 |
|
3.5cm 培養皿 |
8 |
3.0 |
2.0×106 |
|
6cm 培養皿 |
21 |
5.0 |
5.2×106 |
|
9cm 培養皿 |
49 |
10.0 |
12.2×106 |
|
10cm 培養皿 |
55 |
10.0 |
13.7×106 |
|
25cm 塑料培養瓶 |
25 |
5.0 |
5.2×106 |
|
75cm 塑料培養瓶 |
75 |
15~30 |
2×107 |
|
25cm 玻璃培養瓶 |
19 |
4.0 |
3×106 |
|
100cm 玻璃培養瓶 |
37.5 |
10.0 |
6×106 |
|
250cm 玻璃培養瓶 |
78 |
15.0 |
2×107 |
|
2500cm 旋轉培養瓶 |
700 |
100~250 |
2.5×108 |
注：各種單層生長的細胞在培養皿中長滿的細胞數，主要取決于器皿底表面積和細胞體積的大小。上表以293 細胞為例給出的可獲細胞量僅作參考。
6．如何選用細胞培養基
培養基是維持體外細胞生存和生長的基本溶液，是組織細胞培養時**重要的條件。細胞培養基大致有：
（1）合成培養基
主要成分為：氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、輔助物質（核酸降解物、氧化還原劑等）。常用的有：
①199細胞培養基及其改良品種。 1950年由Morgan 等設計，除BSS 外，含有53 種成分，添加適量的血清后，可廣泛用于多種細胞培養、病毒學、疫苗生產等。 199 （HB）細胞培養基，主要應用于Vero 細胞、地鼠腎細胞轉瓶培養生產狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩沖性能，能夠有效提高病毒滴度。
②BME細胞培養基。基礎Eagle 培養基（Basal Medium Eagle），1955 年由Eagle 設計，BSS＋12 種氨基酸＋谷氨酰胺＋8種維生素。簡單、便于添加，適于各種傳代細胞系和特殊研究用，在此基礎上改良的細胞培養基品種有MEM、DMEM、IMDM 等。
③MEM細胞培養基。低限量Eagle 培養基（Minimal Essential Medium），1959 年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細胞單層生長，是一種**基本、適用范圍**廣的培養基，是一種被廣泛應用的培養基。需要注意的是，MEM 細胞培養基有含 Earle's 平衡鹽的類型，也有含 Hanks'平衡鹽的類型；有高壓滅菌型的，也有過濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類型。生產和科研時，應根據實際情況注意選擇合適的MEM 細胞培養基。另外，因MEM 培養基營養成分所限，針對生產之特定細胞培養與表達時，并不一定是使用效果**佳或者**經濟的培養基。
④DMEM細胞培養基及其改良品種。 DMEM 由Dulbecco 改良的Eagle 培養基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L ）。細胞生長快。附著稍差的腫瘤細胞、克隆培養用高糖效果較好，常用于雜交瘤的骨髓瘤細胞和DNA 轉染的轉化細胞培養。例如CHO 細胞表達生產乙肝疫苗、CHO 細胞表達EPO。
⑤IMDM 細胞培養基。 IMDM 是由Iscove's 改良的Eagle 培養基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量。可用于雜交瘤細胞培養，以及無血清培養的基礎培養基。
⑥RPMI-1640 細胞培養基。 Moore 等人于1967 年在Roswell Park Memorial Institute 研制，針對淋巴細胞培養設計，BSS＋21 種氨基酸＋維生素11 種等，廣泛適于許多種正常細胞和腫瘤細胞，也用做懸浮細胞培養。 #p#分頁標題#e#
⑦Fischer’s細胞培養基。用于白血病微粒細胞培養。 #p#分頁標題#e#
⑧HamF10、F12 細胞培養基。 1963 年、1969 年由Ham 設計，含微量元素，可在血清含量低時用，適用于克隆化培養。F10 適用于倉鼠、人二倍體細胞，F12 適用于CHO 細胞。
⑨DMEM/F12細胞培養基。 DMEM 和F12 細胞培養基按照 1:1 比例混合效果**佳，營養成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養基的基礎培養基。
（2）低血清細胞培養基
主要應用于VERO 細胞、BHK21 細胞等細胞在轉瓶、微載體反應器中的培養。
（3）無血清培養基
是設計用來在無血清條件下促使特殊類型的細胞生長或進行專門應用的培養基。需要添加生長因子和或細胞因子，含有個別蛋白或大量蛋白組分。
（4）替代天然培養基
培養基中不包含有蛋白、水解產物或未知結構的組分，所有的成分均有已知的化學結構。面對如此多的細胞培養基，對細胞培養基的選用，建議：
①可以查閱相關文獻，或在購買細胞株時咨詢選用**適合細胞株的培養基，或購買相配套的細胞培養基產品。
②許多培養基都適合多種細胞株的培養，可以采用現有的培養基進行試驗。
③根據細胞株的特點、實驗的需要來選擇培養基。如小鼠細胞株多選 1640；進行細胞雜交、基因轉移實驗，可選擇IMDM。
④結合細胞特性及培養基的培養效能，用多種培養基培養目的細胞，觀察其生長狀態，可以用生長曲線、克隆形成率等指標判斷，根據實驗結果選擇**佳培養基。
注：目前也有不少商業化的msc培養基，如百恩維的間充質干細胞無血清培養基，間充質干細胞培養基（低血清）
7．如何維持培養液 p H
配好的培養液變堿（變紫紅）是正常的現象。暴露在空氣中的培養液，因為大氣中二氧化碳的濃度很低，培養液中的HCO3 -被漸漸耗掉，培養液的pH值也逐漸升高，變成了紫紅色。如果培養基pH值偏堿的程度不大，可將裝培養液的瓶口擰松，放置于
二氧化碳培養箱中一段時間，讓
培養箱中的CO2進入培養液，pH值就可以糾正。如果pH值偏離的程度很大，可以通過添加少量無菌的H Cl 或者NaOH調節pH，便可以使用。將配制好的培養基小劑量分裝，可以避免反復開蓋引起其中的二氧化碳逸出而造成pH升高。同時因NaHCO3遇熱不穩定，會分解釋放出CO2 ，而使培養基的pH升高，偏堿。因此在配置使用培養的過程中應注意：
（1）動作迅速，不可使培養液長時間處于較高室溫下；
（2）配置過程中，混勻時切不可加熱。混勻后應立即放入4°C 冰箱，待過濾時再取出；
（3）使用完畢應盡快將瓶口封好，放于4°C 冰箱保存。
通過在培養液中同時添加Hepes 也可以有效的穩定pH 值。Hepes （羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種非離子兩性緩沖液,它在pH 7.2～7.4范圍內具有較好的緩沖能力。其**大優點是在開放式培養或細胞觀察時能維持較恒定的pH 值。在這種培養條件下，細胞培養瓶的蓋子應擰緊，以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。該緩沖液使用的終濃度為10～50mmol/L，一般培養液內含20mmol/L Hepes 便可達到緩沖能力。Hepes 的使用方法有以下兩種：
（1）Hepes 可按所需的濃度直接加入到配制的培養液中，再過濾除菌。每1000ml 培養液中加入2.38 克HEPES，溶解后用1N NaOH 調pH **7.2，過濾除菌后使用。此時HEPES 的使用濃度為10 mmol/L。
（2）配成 100x 貯存液（1 mol/L），使用前取 99mL 培養液加入 lmL 貯存液，**終應用濃度仍為 10 mmol/L。1 mol/L （100x）Hepes 貯存液配制方法：取23.8g Hepes 溶于90ml 雙蒸水中，用1N NaOH 調pH **7.5～8.0，然后用水定容**100mL，過濾除菌，分裝小瓶（2mL/瓶），4℃或-20℃保存。
8．血清與干細胞的培養
干細胞在體內存在的量很少，處在一個個環境相對穩定的“niche”中，所以一旦完成分離進入體外環境，**重要的就是保證細胞的活力不受影響，那么就必須提供一個相對穩定的培養環境。這些環境就是靠培養基和
培養箱來提供了。培養液中**重要的莫過----血清，特別是對干細胞來說。所以為了**優的干細胞培養效果，推薦選用對應的干細胞專用血清。牛血清是**常用的，但是根據血清的來源不同又可以分為小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清應取自剖腹產的胎牛；新牛血清取自出生24 小時之內的新生牛；小牛血清取自出生10－30 天的小牛。顯然，胎牛血清是品質**高的，因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞有害的成分**少，所以也成為了干細胞培養的**。 培養中如何正確的使用血清？避免不好的影響呢？
血清的濃度：對大部分的干細胞，**佳的血清濃度是10%。過高的血清濃度會導致細胞出現分化的現象，如果是需要高濃度的血清，培養的時間也不能超過兩周，否則會導致細胞分化能力下降。過低的血清會導致細胞的增殖速度下降。血清的溶解：必須在 4℃進行，**好過夜溶解。這樣可以減少沉淀的產生，避免營養物質的流式。同時也要避免血清的過濾，如果需要過濾可以和培養基一起過濾。細胞培養液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是**常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質量與胎牛血清的質量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質，其質量明顯不如前兩種。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
血清的質量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質。注意以下幾點：
（1）需要長期保存的血清必須儲存于-20℃或-80℃低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時間切勿超過1 個月。由于血清結冰時體積會增加約10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一定體積空間，否則易發生污染或玻璃瓶凍裂。
（2）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 ℃或 -80 ℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發生。切勿直接將血清從-20 ℃進入37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝集而出現沉淀。影響使用效果！
（3）熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement ）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質量。補體參與反應有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發生化學趨化和活化。
（4 ）切勿將血清在 37℃放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破壞而影響血清質量。
（5）血清中的沉淀物 絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下“小黑點”：經過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長。
9．胎牛血清（F B S ）是否需要滅活
滅活的目的是去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產生細胞毒害作用。胎牛血清（FBS）對許多細胞系均有促生長作用，主要適用于細胞株的保藏及特殊用途的細胞株的體外培養。胎牛血清是取自剖腹產的胎牛。因為胎牛還未接觸外界，血清中所含的抗體、補體等對細胞生長有害的成分**少，質量是**高的。所以不必要滅活。
10．細胞的細菌、真菌污染及排除
真菌污染是細胞培養過程中**常見的一種，尤其在梅雨季節進行細胞培養更易污染。污染培養細胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數在培養液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發現，短期內培養液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態呈卵形，散在細胞周邊和細胞之間生長。鏡下看時，要將培養瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但**后由于營養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。
細菌是一種原核細胞微生物，其大小以微米（μm）計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌、假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。一旦發生細菌污染較易發現，多數情況下培養液短期內顏色變黃，表明有大量酸性物質產生，出現明顯混濁現象；有時靜置的培養液液體初看不混濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起。倒置顯微鏡下觀察，可見培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養液涂片染色檢查以證實細菌種類；有的培養液改變不明顯而又疑有污染，可取出少量培養液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可取 10ml 細胞懸液以 100rpm 離心5min，沉淀中加入無抗生素的培養液2ml，置于37℃培養，24h 可得結果。污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗， **后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。
細菌和真菌污染多在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發生，而且由于增生迅速，多再發生污染48h以內就已明顯。在實驗的**初兩天密切觀察實驗樣品是否有污染發生，有利于及時采取措施予以補救或排除。培養細胞一經污染，多數較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之；有細胞株留存的或可購置的，可在尋找原因后徹底消毒操作室和
二氧化碳培養箱(若發現真菌污染，可在污染孔內加入1mol/L氫氧化鈉或硫酸銅
11．細胞培養污染的預防
溶液處理（具體操作方法可參考細胞培養污染的預防），復蘇或重新購置細胞，再培養。若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采用5～10 倍于常用量的抗生素沖擊，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規培養液，有時可能奏效。細胞培養中常用的抗生素及用量見下表。
常用抗生素用量和效應 #p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
|
抗生素 |
抗菌譜 |
濃度（量/mL） |
|
細菌 |
真菌 |
支原體 |
|
青霉素 |
G+ |
|
|
100～1000μg |
|
鏈霉素 |
G- |
|
|
100～1000μg |
|
慶大霉素 |
G+ /G- |
|
+ |
50～200μg |
|
四環素 |
G+ /G- |
|
+ |
10～50μg |
|
卡那霉素 |
G+ /G- |
|
+ |
100～1000μg |
|
兩性霉素 |
|
+ |
|
常用2μg/mL |
|
制霉菌素 |
|
+ |
|
常用25μg/mL |
+表示效應程度
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
（1）在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
（2）分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B 推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml 。
（3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
（4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3 倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3 代。
（5）在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
（6）重復步驟4 。
（7）在無抗生素的培養基中培養4～6 代，確定污染是否以已被消除。
12．使用胰蛋白酶時加入 E DTA的目的是什么
體外培養的細胞受到嚴重污染時，有時即使想盡各種辦法也難以挽回。因此，防止污染，預防是關鍵。只有將預防措施貫穿于整個細胞培養的始終，才能將發生污染的可能性降到**小程度。 一般預防可從以下幾方面著手：
（1）添加抗生素 各種抗生素性質不同，對各種微生物的作用也不同，聯合應用比單用效果好，預防性應用比污染后使用好（但迄今尚無對抗支原體特效抗生素）。但反復使用抗生素會使微生物產生耐藥性，且對細胞本身也有
一定影響，因此為避免誘導抗藥細菌，應定期更換培養系統中的抗生素，或盡可能不用抗生素處理。
（2）從物品、用品消毒滅菌著手 細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在取樣檢菌一周后確認無菌才能使用。同時，在無菌過濾操作中，隨著濾過體積的增大，濾膜破損的可能性增加，故應選擇**后過濾的液體進行檢測。定期對
二氧化碳培養箱進行消毒。具體操作：75%的酒精搽拭
培養箱后，使用可移動的紫外燈**少消毒30min，加入高壓滅菌過的超純水于培養箱水槽中保持濕度。也可配制300ml 的飽和硫酸銅加3L 滅菌超純水混合成硫酸銅溶液加入水槽中。
（3）從操作者做起
①進無菌室前要徹底洗手，按規定穿隔離衣。開始操作前要用 75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
②操作者動作要輕，安裝吸管帽、打開或封閉瓶口等操作應在火焰近處并經過燒灼進行。但要注意，金屬器械不能在火焰中長時間燒灼，以防退火；燒過的器械要冷卻后才能使用；已吸過培養液的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管內的培養液成分如蛋白質等燒焦后會產生有害物質，吸管再用時會將其帶到培養液中；膠塞、橡皮乳頭及塑料的細胞培養用品過火焰是也不能時間太長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞，同時塑料細胞培養用品也會產生變形影響使用。
③使用培養液前不宜過早開瓶，開瓶后的培養液應保持斜位，避免直立，以防止下落細菌的污染。不再使用的培養液應立即封閉瓶口，培養的細胞在處理之前勿過早暴露在空氣中。
④操作時盡量不要談話，咳嗽以防止來自唾沫和呼出的氣流所造成的污染。 #p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
⑤吸取培養液、細胞懸液時，應專管專用，一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去，以防止污染擴大或造成培養物之間的交叉污染。
⑥操作完畢后應整理好工作臺面，用消毒水浸泡的紗布擦拭臺面。
（4）防止細胞交叉污染 所有從別處轉來的或是自己所建的細胞系都要早期留有的充足的凍存儲備，一旦懷疑發生交叉污染，可做細胞遺傳學方面的鑒定，如發現原有的細胞遺傳物發生改變，可以復蘇早期凍存的細胞使用。重要細胞系（株）的傳代工作應由兩人獨立進行。
（5）無菌室的徹底消毒
①新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室。使用前應稀釋即配即用。新潔爾滅和酒精相比，**大的優點是便宜，因為新潔爾滅 500ml只需5元，而且可以稀釋50倍用，而同樣量的酒精價格可能是新潔爾滅的幾十倍。
②甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣體對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。甲醛價廉，熏蒸消毒時不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛。
13．膠原酶的種類和選型
在細胞的取材中，各種消化酶經常用于組織的分散，在組織中取得目的細胞。例如脂肪間質干細胞（ADSCs ）、軟骨細胞培養等。其中膠原酶是**常用的一種。
種類：I-IV 型選擇：結締組織I，III 型；骨組織、脂肪組織I 型；軟骨組織II 型；胰島細胞IV 型。崩裂酶Dispase作用：用于增強膠原酶的消化能力，對細胞損傷**小。
14．膠原酶 V S胰酶
胰蛋白酶（Trypsin ），簡稱胰酶，可使細胞間的蛋白質水解從而達到細胞離散的目的，是目前應用**為廣泛的消化劑，主要采自牛或豬的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應在低溫干燥處保存。胰酶適用于細胞間質較少的軟組織（如胚胎、上皮、羊膜、肝、腎等軟組織）及傳代細胞的消化，但對于纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125 和1：250，即一份胰酶可消化125 或250 份酪蛋白。組織培養用胰酶溶液一般配制成0.1~0.25%濃度，常用0.25%，特別敏感的可以使用0.125%。胰酶的消化效果主要于pH 值、溫度、胰酶的濃度、組織塊的大小和硬度有關。胰酶作用及溶解的**佳pH 是8~9，配制胰酶溶液可將液體調**pH8 左右，充分溶解，過濾除菌，過濾后再調**pH7.4 左右。胰酶作用的**適溫度為37℃，在夏季室溫25℃以上對一般傳代細胞也能達到消化效果。一般新鮮配制的胰酶消化能力較強。消化時間要根據不同的情況而定，胰酶對細胞的分離效果與細胞的類型、特性和瓶壁表面特性有關。一般來說，溫度低，組織塊大、胰酶濃度低者，消化時間長，反之則相應減少時間。酶的濃度過大或消化時間太長，會導致消化過度，對細胞的活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，被消化掉；消化時間太短，消化不足則細胞難于從瓶壁上吹下，反復吹打同樣也會損傷細胞活性，也達不到分散細胞的目的。影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或 4℃保存時間長短、是否反復凍融、化凍后存放時間及溫度等）、消化時的溫度（氣溫、細胞培養瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等。在使用胰酶進行消化時，可改變不同參數以確定出**佳消化效果。
胰酶的配置方法：
（1）稱取胰酶：按胰酶液濃度為0.25 ％，用電子天平準確稱取粉劑溶入PBS 或D-hanks 中，低速攪拌3~4小時或者置于 4℃過夜混勻（低速很重要，機械攪拌對酶是一種沖擊，如果起沫嚴重，有可能導致酶的變性）。
（0）調節pH 值為7.4 左右。用注射濾器過濾除菌，因蛋白制劑不宜4℃長期保存，忌反復凍融，建議分裝成小瓶（離心管）于-20℃凍存或置4℃保存備用。
注意事項：
①是否需要4℃放置過夜，取決于胰酶的純度。過去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要4℃過夜。而現在的胰酶純度都很高，就沒有必要4℃過夜。從理論上來說，4℃放置過夜，給細菌生長的機會，盡管過濾可以除去細菌，但除不掉其代謝產物。
②如果胰酶不溶、有絮狀物，考慮可能的原因有：胰酶過期或是已經部分變性；溶液 pH 值不對；在沒過濾之前的絮狀沉淀是正常現象，因胰酶多取自動物胰腺，沉淀為組織塊，過濾后即可。
③Ca2+、Mg2+、血清和蛋白質對胰酶的活性有一定的抑制作用，所以需用不含Ca2+、Mg2+、這些離子的BSS 如D-Hanks 或者PBS 來配制。正是這個道理，開始消化前，需用PBS 將培養液沖洗干凈后方加入胰酶進行消化，否則會大大影響胰酶的作用效果。終止消化時，可用含有血清培養液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。
④對于一些貼壁特別牢固的細胞，可在上述配方中，加入0.02%的EDTA，將胰酶與EDTA （乙二胺四乙酸）混合來進行消化。EDTA 可通過結合（螯合）細胞間質中的二價陽離子從而破壞細胞連接從而增加消化效力。但因EDTA 不能被血清中和，終止消化后，需用培養液或PBS 徹底沖洗培養瓶（板），使得更好的再次利用培養瓶（板），否則再培養時可能會導致細胞容易脫壁。 EDTA 在常溫下難溶于酸，微溶于水（20℃時溶解度只有 0.02g ），但在堿性溶液中溶解性較大。因此為了更快的溶解 EDTA 可采取調節 PH 或者是加熱的辦法。但須
注意：由于胰酶不耐高溫，因此待EDTA溶解后，溫度有所下降才能加入胰酶。如果是單獨配置 EDTA 溶液，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
膠原酶（collagenase ）是從溶組織梭狀細胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結締組織中膠原蛋白成分。當擬消化的組織較硬，內含較多結締組織或膠原成分時，用胰蛋白酶解離細胞的效果較差，這時可采用膠原酶解離細胞法。膠原酶僅對細胞間質有消化作用而對上皮細胞影響不大。因此適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細胞與膠原成分分離而不受損害。常用劑量為**終濃度 200U/ml （約為1mg/mL ）或0.03%~0.3%。膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細胞專用膠原酶，要根據所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。具體可見膠原酶的種類和選型。膠原酶消化緩和、無須機械振蕩，因而可進一步提高細胞成活率，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。膠原酶的配置膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制、消毒滅菌和儲藏。關于胰蛋白酶配置方法可見：胰蛋白酶消化法。
注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。鈣、鎂離子和血清成分不會影響膠原酶的消化作用，因而可用 BSS （如D-hanks 或者PBS）或含血清的培養液配制。
膠原酶的使用：
（1）將漂洗、修剪干凈的組織剪成1~2mm3左右小塊
（2）將組織塊放入離心管（三角燒瓶）中加入30~50 倍體積的膠原酶溶液，旋緊蓋子（密封燒瓶）。
（3）將燒瓶放入37℃水浴或者37℃孵箱內，每隔3min 振搖一次，如能放在37℃的恒溫震蕩水浴箱中則更好。消化時間與組織的類別很有關系，對于某些腫瘤組織或其他較致密結締組織，消化時間4~48h，對于容易消化的組織可以采用37℃震蕩消化 15~45min，也可以根據具體情況而定。如組織塊已分散而失去塊的形狀，一經搖動即成細胞團或單個細胞，可以認為已消化充分。上皮組織經膠原酶消化后，由于上皮細胞對此酶有耐受性，可能仍有一些細胞團未完全分散，但成團的上皮細胞比分散的單個上皮細胞更易生長，因此，如無特殊需要可以不必再進一步處理。
（4）收集消化液（有時含個別組織塊及沒有充分消化的組織碎屑則需用 100 目不銹鋼網過濾），離心1000r/min，5min，去除上清，用Hanks 液或者無血清培養液離心漂洗1~2 次，去除上清，加培養液制成細胞懸液，接種培養瓶。
膠原酶Vs 胰蛋白酶 胰蛋白酶和膠原酶消化時間與濃度上的差異，依消化溫度而異。另外這兩種酶也可混合應用，濃度為：胰蛋白酶0.1mg+膠原酶0.25mg/mL。兩酶相比的差別見表1 和表2。
表1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
|
項目 |
胰蛋白酶 |
膠原酶 |
|
消化特性 |
適用于消化軟組織 |
適用于消化纖維多的組織 |
|
用量 |
0.01%~0.5% |
0.1~0.3 mg/mL（200 U/mL） |
|
消化時間 |
0.5 ~ 2h |
1 ~ 12h |
|
pH |
8~9 |
6.5~7.0 |
|
作用強度 |
強烈 |
緩和 |
|
細胞影響 |
時間過長有影響 |
無大影響 |
|
血清抑活 |
有 |
無 |
|
Ca2+和Mg2+ |
有影響 |
無影響 |
表2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊（0.5~1cm3 ）時所需時間（h）
|
酶種類和用量 |
較硬組織 |
軟組織 |
|
4℃ |
室溫 |
37℃ |
4℃ |
室溫 |
37℃ |
|
胰蛋白酶（0.25%） |
24~48 |
1~6 |
1~2 |
12~24 |
1~2 |
0.5~1 |
|
膠原酶（1200 U/mL） |
24 |
6 |
0.5 |
12 |
3 |
0.25 |
|
胰蛋白酶（0.25%）+膠原酶（200 U/mL） |
12~46 |
12~24 |
4~12 |
12~24 |
6~12 |
1~2 |
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15．干細胞的種類和表面標記
通過流式細胞儀分析，間充質干細胞特異性表面抗原有：SH2、SH3、 CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124。BMSC：是骨髓中除HSC 以外的非造血性干細胞，骨髓中jue大多數是HSC，BMSC 只占骨髓有核細胞的0.001%～0.01% 。因此鑒定BMSC 的方法是在骨髓的干細胞中排除HSC——BMSC：CD45-、CD34-、CD29+、 CD14+/ HSC：CD34+。
16．間質干細胞培養原理概述
間質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群中胚層來源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細胞，在適宜的培養條件下可分化成多種組織細胞，包括成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等。
間質干細胞**早是從骨髓中分離得到的，正常情況下，它在骨髓中的比例非常低，僅占單核細胞的1/105 ~1/104 。骨髓中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形態和密度與其他細胞不同，紅細胞和多核白細胞密度較大，為1.090 g/ml左右，而淋巴細胞和單核細胞密度為1.075~1.090 g/ml，血小板為1.030~1.035 g/ml。為此利用一種密度介于1.075~1.092 g/ml之間而近于等滲的溶液（分層液）進行密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。
在骨髓的原代培養物中，除了貼壁生長的成纖維細胞樣的間質干細胞外，還混雜著一些巨噬細胞、單核細胞、造血細胞及紅細胞等，要得到較均一的間質干細胞，必須除去其他細胞。根據其他細胞的特性，可采用不同的方式排除它們。對于紅細胞，因其不貼壁，可通過換液除去。對于貼壁的單核巨噬細胞，可根據其黏附能力的不同，通過調整Trypsin/EDTA 的消化時間，保證間質干細胞在短暫的作用時間內與塑料培養瓶壁分離，而巨噬細胞、單核細胞、造血細胞等仍貼附于培養瓶壁，從而使間質干細胞與其他的貼壁細胞得到分離。
在傳代培養中，接種密度是影響體外培養間質干細胞增殖潛能的重要因素。低密度接種時，間質干細胞的增殖能力明顯提高，而誘導細胞分化時則需要較高的細胞密度，這可能與分化時細胞與細胞間的相互作用有關。而在培養過程中，若細胞過度融合會促進其分化趨向，故要保持干細胞未分化狀態，要及時傳代。
17．間質干細胞成脂和成骨誘導分化
成骨和成脂誘導是鑒定干細胞的一種重要的方法，也是**常用、報道見得**多的方法。成骨**常用的染色方法是茜素紅染色（堿性磷酸酶），成脂誘導**常用是Oil Red O （油紅O）染色法。下面我介紹一下這兩種染色方法的原理和步驟。 茜素紅染色方法和原理：成骨誘導的過程是使鈣離子能夠以鈣鹽的方式沉淀下來，這就是我們常說的“鈣結節”。鑒定鈣結節的染色方法常用“茜素紅”。
步驟：
（1）吸去誘導液，再PBS 洗一到兩次；
（2）加入10％中性甲醛，固定30min-60min；
（3）吸去固定液，加入0.1%的茜素紅染色液，染色6-10min；
（4）用PBS 洗兩次，去處殘留的染色液；
（5）加入PBS，完成染色；
茜素紅：茜素磺酸鈉，茜素S，茜素紅S，茜素胭脂紅，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉，1,2-二羥基蒽醌-3-磺酸鈉鹽。橙黃色或黃棕色粉末。易溶于水，微溶于乙醇，不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH 為2.15，其水溶液呈淺黃褐色，加鹽酸后變成黃色，加氫氧化鈉后則變成藍紫色。有刺激性。能與許多金屬離子生成帶色化合物，能與鋯、釷、鋁、鈦及鈹和鈣的顯色反應。染色的原理就是茜素紅和鈣發生顯色反應，產生一種深紅色的帶色化合物，這樣成骨誘導的細胞外面沉積的鈣結節也就被染成了深紅色。
Oil Red O（油紅O）染色的方法和原理：成脂肪誘導的過程中，細胞在胞漿中不斷有油滴的累積，并不斷的增加變大，**后整個細胞的胞漿中都是油滴。Oil Red O染色的方法是對油滴的染色的一種方法。
步驟：
（1）吸去誘導液，再PBS 洗一到兩次；
（2）加入10％中性甲醛，固定60min；
（3）吸去固定液，加入現配和過濾后的Oil Red O 染色液，染色60min；
（4）用PBS 洗2-5 次，去處殘留的染色液和殘渣；
（5）加入PBS，完成染色；
Oil Red O（油紅O）：1-［2,5-二甲基-4-(2,5-二甲基苯偶氮)苯偶氮］-2 萘酚，蘇丹紅5B，溶劑紅27。紅色粉末。是一種油溶性偶氮染料。易溶于苯，溶于乙醇(呈淺黃色紅色)和丙酮。生物染色劑,淀粉凝膠電泳中作類脂和脂肪染色。顯微技術中用作脂肪染色劑。作為脂肪細胞的染色劑的原理是使用Oil Red O 的油溶性，對其它的細胞結構著色性差。
18．干細胞老化的表現和處理
干細胞在培養過程中如果環境不適合其生長就會出現部分細胞的老化現象。這是干細胞培養的一個難點也是經常出現的問題。 干細胞老化表現： 細胞胞漿內特別是在核區附近出現黑色顆粒，表示細胞開始出現老化；細胞胞漿內出現空泡，則表明該細胞已老化或者已經開始分化（在全部細胞中出現少數老化細胞是正常的）；細胞立體感逐漸消失，細胞間的間隔不清，部分細胞扁平狀，細胞的形狀趨向多樣； 貼壁性減退，出現一些漂浮的細胞；部分分泌強的細胞分泌物增多，細胞表面會比較臟；細胞增殖速度明顯下降，分裂相的細胞明顯減少。 #p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
干細胞老化的原因和預防： 接種密度的影響：部分干細胞具有一定的分泌性能，能夠分泌一些對細胞有支持能力的因子類物質；所以必須維持一定的接種密度，否則會導致細胞增殖減慢，**后出現老化； 消化過度：消化細胞時會對細胞的表面蛋白有較強的損傷，所以消化的時間不能過長，使用合適濃度和pH 值的消化酶，否則會導致細胞老化和分化；
合適的密度的時候就要傳代：細胞如果過密，接觸抑制作用會導致細胞的活力減弱并影響增殖導致老化；
使用合適的血清和培養基：不同的干細胞對培養基特別是血清的要求不同，所以使用不同的培養用的血清進行篩選，尋找**適合該干細胞培養的血清是預防細胞老化，維持細胞正常生長的重要保證。
19．細胞傳代消化過程指導
干細胞的培養中，消化傳代對細胞的影響**大，所以合適的消化操作會大大減小胰酶對干細胞的傷害。應該仔細摸索后確定目的細胞**佳的消化時間。確保大部分細胞都能消化下來，而消化時間**少。
注意要點：
（1）切忌過度消化（包括胰酶濃度過高、消化時間過長），會導致細胞死亡、分化、狀態變差，分化能力丟失。所以不熟練的操作者，寧可消化不徹底，也不能消化過度；要確保細胞不消化過度，**好在顯微鏡下觀察消化的過程。
（2）在加入完全培養液終止胰酶作用前，可以在細胞培養瓶的左右兩側和底部輕輕拍打，使細胞脫壁懸浮。加入完全培養基后，再用吸管輕輕吹洗幾次培養瓶的底面；
（3）細胞的差異：不同種類的干細胞的差異很大，特別與腫瘤細胞株的差異更大，很多經驗不可以直接使用，要仔細摸索**佳的時間；
（4）接種的密度不能過低，否則會導致細胞增殖緩慢，甚**導致細胞老化，
20．冷凍保護劑作用和選擇
冷凍保護劑是指可以保護細胞免受冷凍損傷的物質。冷凍保護劑常常配制成一定的溶液。一般來講，只有紅細胞、大多數微生物和極少數有核的哺乳動物細胞懸浮在不加冷凍保護劑的水或簡單的鹽溶液中，并以**適的冷凍速率冷凍，可以獲得活的凍存物。但對于大多數有核哺乳動物細胞來說，在不加冷凍保護劑的情況下，無**適冷凍速率可言，也不能獲得活的冷凍物。例如將小鼠骨髓細胞懸浮在不加冷凍保護劑的平衡鹽溶液中，并以0.3～600℃/min 的冷凍速率降溫冷凍，98% 以上的細胞會死亡；而加入甘油冷凍保護劑進行冷凍保存時，98% 以上的細胞都可存活。
冷凍保護劑可分為滲透性和非滲透性兩類。滲透性冷凍保護劑可以滲透到細胞內，一般是一些小分子物質，主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保護機制是在細胞冷凍懸液完全凝固之前，滲透到細胞內，在細胞內外產生一定的摩爾濃度，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，從而保護細胞免受高濃度電解質的損傷，同時，細胞內水分也不會過分外滲，避免了細胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不防止細胞內結冰，在使用該類冷凍保護劑時，需要一定的時間進行預冷，讓甘油或DMSO等成分滲透到細胞內，在細胞內外達到平衡以起到充分的保護作用。目前DMSO的應用比甘油更為廣泛，但要注意的是，DMSO在常溫下對細胞的毒性作用較大，而在4℃時，其毒性作用大大減弱，且仍能以較快的速度滲透到細胞內。所以，凍存時DMSO平衡多在4℃下進行，一般需要40～60分鐘。
非滲透性冷凍保護劑不能滲透到細胞內，一般是些大分子物質，主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羥乙基淀粉等。其保護機制的假說很多，其中有一種可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物質可以優先同溶液中水分子結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷。
不同的冷凍保護劑有不同的優、缺點。目前一般多采用聯合使用兩種以上冷凍保護劑組成保護液。由于許多冷凍保護劑（如 DMSO）在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，故在細胞復溫后應及時洗滌冷凍保護劑。
21．細胞凍存
21.1細胞懸液的制備
(1)按常規方法消化處于對數生長期的細胞培養物，制備單細胞懸液，并計算細胞總數；
(2)將細胞懸液以800～1000r/min 離心5min，去上清液；
(3)向細胞沉淀物中加入細胞凍存液，輕輕吹打混勻，使細胞密度達1×106～1×107個/ml ；
(4)按每管0.5-1ml 的量分裝于凍存管內，擰緊管蓋；
(5)在凍存管上做好標記，包括細胞名稱、代次及凍存日期等內容。
21.2凍存
為保持細胞**大存活率，凍存時要遵循“慢凍快融”的原則。標準的降溫速度是1-2℃/min ，當溫度到達 -25℃，降溫速度可加快**5-10℃/min，到-80℃可直接入液氮。
分級冷凍
(1)先將凍存管放入普通冰箱冷藏室（4～8℃），約30min；
(2)接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室（-10℃～-20℃），約1-2 小時；
(3)然后將凍存管轉移到超低溫冰箱（-70℃～-80℃），過夜；
(4)**后將凍存管投入液氮中保存。
降溫過程也可使用專為細胞凍存設計的程序冷凍儀，我們采用的是將凍存管放入凍存盒里，再放入-80℃過夜，由于聚氯乙烯導熱比較慢，所以溫度可慢慢降下來，次日可直接放入液氮罐。這樣可以保證細胞的活力不受到溫度變化速率的影響。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
21.3注意：在使用DMSO前，不用進行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會破壞其分子結構，以致降低冷凍保護效果。也不能使用普通的砜類材料的過濾膜來進行過濾。在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制時**好帶手套。凍存液**好現用現配。在將細胞凍存管投入液氮時，操作過程中**好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋，動作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內濺出，對皮膚造成凍傷。應注意控制凍存細胞的質量。既要在凍存前保障細胞具有高活力，還要確保無微生物污染，這樣的細胞才具有凍存價值。另外，在每批細胞凍存一段時間后，可復蘇1～2 管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因為在復蘇時，需要從-196℃的液氮中取出凍存管，立即投入37～40℃溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發生危險。
22．干細胞冷凍和復蘇
冷凍速率：冷凍速率是指降溫的速度，直接關系到冷凍效果。細胞在冷凍過程中會發生如下變化：當細胞被冷**-5℃時，因溶液中加有冷凍保護劑而降低溶液的冰點，細胞內外溶液仍未結冰；當被冷**-5～-15℃之間時，細胞外溶液先出現結冰而細胞內仍保持未結冰狀態。細胞內未結冰的水分子會比細胞外部分結冰溶液中的水分子具有更高的化學能。其結果是，細胞內水分子為了和細胞外水分子保持化學能的平衡，會向細胞外流動。冷凍速度不同，細胞內水分向外流動的情況也不相同：如果冷凍速度慢，細胞內水分外滲多，細胞脫水，體積縮小，細胞內溶質濃度增高，細胞內不會發生結冰；如果冷凍速度快，細胞內水分沒有足夠的時間外滲，結果隨著溫度的下降而發生細胞內結冰；如果冷凍速度非常快（即超快速冷凍），則細胞內形成的冰晶非常小或不結冰而呈玻璃狀態（玻璃化冷凍）。Luyet （1973）證實液體的凝固可分為兩種形式：一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態，保持未凝固前的狀態。
不同的冷凍速度既然能使細胞內發生不同的生理變化，也可以對細胞產生不同的損傷。當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重，細胞體積嚴重收縮，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢，還會引起細胞外溶液部分結冰，從而使細胞外未結冰的溶液中溶質濃度增高，產生溶質損傷。當冷凍速度過快時，細胞內水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細胞膜及細胞器的破壞，產生細胞內冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細胞存活來說是**為理想的冷凍方法。細胞內外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細胞膜和細胞器不致造成損傷，細胞也不會在高濃度的溶質中長時間暴露而受損。
不同細胞的**適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細胞、酵母、人紅細胞的**適冷凍速率分別為1.6℃/min、7℃/min 和200℃/min 。細胞與細胞之間的**適冷凍速率可在1.6℃～300℃/min ，故對一種細胞進行冷凍保存之前，shou先需要測定其**適冷凍速率，以保證獲得**高的冷凍存活率。
復蘇速率：冷凍保護體外培養物，除了必須有**佳的冷凍速率、合適的冷凍保護劑和凍存溫度外，在復蘇時也必須有**佳的復溫速率，這樣才能保證**后獲得**佳冷凍保存效果。 復溫速率是指在細胞復蘇時溫度升高的速度。復溫速率不當也會降低凍存細胞存活率。一般來說，復溫速度越快越好。常規的做法是，在37℃水浴中，于1-2 分鐘內完成復蘇。復溫速度過慢，細胞內往往重新形成較大冰晶而造成細胞損傷。復溫時造成的細胞損傷非常快，往往在極短的時間內發生。在低于-70℃的超低溫條件下，有機體細胞內部的生化反應極其緩慢，甚**終止。因此，采取適當的方法將生物材料降**超低溫，即可使生命活動固定在某一階段而不衰老死亡。當以適當的方法將凍存的生物材料恢復**常溫時，其內部的生化反應可恢復正常。
所謂冷凍保存，就是將體外培養物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降**零下某一溫度（一般是低于-70℃的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復蘇就是以一定的復溫速率將凍存的體外培養物或生物活性材料恢復到常溫的過程。不論是微生物、動物細胞、植物細胞還是體外培養的器官都可以進行凍存，并在適當條件下復蘇。
水在低于零度的條件下會結冰。如果將細胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細胞內外的水分都會結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡。這種因細胞內部結冰而導致的細胞損傷稱為細胞內冰晶的損傷。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細胞外部的水分會shou先結冰，從而使得未結冰的溶液中電解質濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質的溶液中且時間過長，細胞膜上脂質分子會受到損壞，細胞便發生滲漏，在復溫時，大量水分會因此進入細胞內，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質損傷或稱溶液損傷。當溫度進一步下降，細胞內外都結冰，產生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑，則可保護細胞免受溶質損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結合，從而降低冰點，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結冰溶液中電解質的濃度，使細胞免受溶質損傷，細胞得以在超低溫條件下保存。在復蘇時，一般以很快的速度升溫，1-2 分鐘內即恢復到常溫，細胞內外不會重新形成較大的冰晶，也不會暴露在高濃度的電解質溶液中過長的時間，從而無冰晶損傷和溶質損傷產生，凍存的細胞經復蘇后仍保持其正常的結構和功能。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率、冷凍溫度和復蘇溫度變化速率有關。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣。
細胞復蘇步驟和注意要點：
（1）準備37°C水浴和預熱到 37°C 的完全培養液；準備好一個15ml 的離心管，同時加入9ml 的完全培養液；
（2）準備好這些后，將細胞從液氮中取出，放入到
水浴鍋中，同時輕輕搖動，保證細胞能夠在3min 內完全溶解，同時應該注意不要把凍存管的管口沒入水浴中（可能由水引起污染）。 注意要點：溶解的時間過長會影響細胞的活力，導致死細胞多，細胞狀態差；如果從液氮中取出，管內有少量液氮要先-80℃放置10-30 分鐘，使液氮完全揮發再復蘇，避免危險。
（3）溶解完全的細胞要快速轉移到無菌超凈臺中，用 75％酒精棉球擦外表面。用吸管將凍存管中細胞懸液吸到15ml 的含有培養液的離心管中，同時用培養液洗2 次凍存管，一起加到離心管中吹勻，避免產生泡沫。 注意要點：細胞吸出后，用培養液再洗 2 次凍存管，把細胞全部轉移，否則會損失細胞。吹勻時如果很多泡沫會影響細胞活力，導致復蘇后死細胞偏多。
（4）250 g 離心 5 minutes；棄上清液，加入2-3ml 預熱的完全培養基，輕輕吹勻，保證細胞完全重懸。 注意要點：離心的作用是去除細胞凍存液中DMSO 對細胞的影響，否則會導致干細胞分化。重懸務必保證所有的細胞均勻分開，否則會導致細胞成團或者細胞還在貼在底部，損失細胞。去除上清時，要小心（特別是使用5-10ml 移液管）避免將細胞吸走，導致細胞數損失，操作熟練的人員，可以直接倒去上清。
（5）將重懸的細胞接種到T25 或者是T75 的培養瓶中，加入適量的培養液，再把細胞搖均勻，放入37°C 、5% CO2 培養箱中。注意要點：接種到T25 可以比較安全的復蘇，推薦新手操作。這樣必須在 24-48 小時后傳代。搖勻時要左右輕輕搖動，保證所有的細胞能夠均勻的分布。
（6）第二天進行換液，保證去除死細胞。正常的培養過程是三天進行一次換液，如果細胞長到有80-90 ％匯合進行傳代。
注意事項：第二天換液可以去除死細胞對正常細胞的影響，正常的復蘇情況下是會有少量的死細胞。細胞在80-90％匯合必須進行傳代，否則會由于接觸抑制而導致細胞的狀態變差或者是消化后成團。
